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不同环境温度下BLE对小鼠泌尿生殖系统的影响

  • 上传者:诸葛月月
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文档分类: 临床医学

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关于本文

  • 本文标题:不同环境温度下BLE对小鼠泌尿生殖系统的影响.docx
  • 链接地址:https://wk.sbvv.cn/view/16277.html
  • 内容摘要:目录摘要IAbstractIII主要符号对照表V第1章前言61。1竹叶提取物的研究进展61。1。1竹叶提取物抗氧化功效61。1。2竹叶提取物抗炎抑菌作用61。2冷应激61。2。1冷应激对生物的影响61。2。2冷应激对动物各组织的影响71。2。3冷应激对动物生殖器官的影响71。2。4冷应激对生育能力的影响81。3研究目的及意义81。4研究内容及技术路线91。4。1研究内容91。4。2技术路线9第2章不同环境温度下灌注BLE实验方法学的建立102。1材料与方法102。1。1主要仪器及试剂102。1。2竹叶提取物的制备102。1。3实验动物102。2动物分组及方法102。2。1样本采集112。2。2检测指标与方法112。2。2。1脏器系数测定112。2。2。2血清中SOD检测112。2。2。3肝脏中SOD及MDA检测112。2。2。4血清中IL2、IFNγ检测112。2。2。5血清中雌二醇检测112。2。2。6数据分析122。3实验结果122。3。1脏器系数检测结果122。3。2血清中SOD及肝脏中SOD、MDA结果122。3。3血清中IL2、IFNγ结果122。3。4血清中雌二醇结果132。4讨论132。4。1不同环境温度下灌注BLE对小鼠脏器系数的影响132。4。2不同环境温度下灌注BLE对小鼠血清中SOD和肝脏中SOD、MDA的影响132。4。1不同环境温度下灌注BLE对小鼠免疫因子的影响14第3章不同环境温度下BLE对小鼠泌尿生殖系统的影响153。1材料与方法153。1。1试验材料153。1。2试验动物153。1。2主要仪器和试剂153。2试验方法153。2。1卵巢病理组织学观察163。2。2肾脏病理组织学观察163。2。3不同环境温度下BLE对小鼠肾脏组织细胞凋亡率的检测163。3数据处理163。4试验结果173。4。1卵巢病理组织学观察结果173。4。2肾脏病理组织学观察结果183。4。3不同环境温度下BLE对小鼠肾脏组织细胞凋亡率的检测203。5讨论213。4。1不同温度下灌注BLE对小鼠卵巢病理组织学的影响213。4。2不同环境温度下灌注BLE对小鼠肾脏病理组织学影响223。4。3不同环境温度下BLE对小鼠肾脏组织细胞凋亡率的影响22第4章结论及有待于进一步研究的问题234。1结论234。2有待进一步研究的问题23参考文献24致谢i关于学位论文原创性的声明ii在学期间的科研情况iii摘要本研究以雌性昆明小鼠为试验动物,以陕西佛坪国家级自然保护区巴山木竹叶提取物(BambooleafextractofBashaniafargesii)为试验材料,以不同温度、不同竹叶提取物(Bambooleafextract,BLE)灌注剂量为试验条件,建立不同环境温度下灌注BLE实验方法学,在此基础上探究不同环境温度下BLE对小鼠泌尿生殖系统的影响,为推测长期处于寒冷环境中的大熊猫在食叶期面临生物或非生物胁迫时,觅食策略是否与竹中此生代谢产物有关提供一种可能性。内容1不同环境温度下灌注BLE实验方法学的建立将60只雌性小鼠随机分为5组,分别为常温对照组:NT+CON(25℃,0mgkgBW)、低温对照组:LT+CON(0℃,0mgkgBW)、低温低剂量组:LT+LBLE0℃,(340mgkgBW)、低温中剂量组:LT+MBLE(0℃,680mgkgBW)、低温高剂量组:LT+HBLE(0℃,1020mgkgBW),每组12只,分笼饲养,持续2周。测定小鼠的脏器系数、血清中超氧化物歧化酶(SOD)含量、肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量以及血清中免疫指标和雌二醇含量。结果表明,不同环境温度下灌注BLE小鼠脏器系数无明显变化;温度会引起血清中SOD以及肝脏中SOD含量下降,低温条件下下灌注低剂量BLE使SOD含量上升,且肝脏中SOD含量显著上升(P0。05),MDA含量变化为低温低剂量组高于其余组;不同灌注浓度下免疫因子含量低温低剂量组最低,不同灌注浓度下低温低剂量组雌二醇含量显著高于中剂量和高剂量组(P0。05)。内容2不同环境温度下BLE对小鼠泌尿生殖系统的影响使用2×2因子设计(温度:25℃、4℃;BLE灌注剂量:0mgkgBW、340mgkgBW),试验组为常温对照组:NT+CON;常温BLE灌注组:NT+BLE;低温对照组:LT+CON;低温BLE灌注组:LT+BLE四个组,每组6个重复,每个重复10只鼠,共240只鼠,开展为期28d的动物体内试验,试验分两个阶段进行研究,14d和28d。通过病理学诊断、细胞凋亡等检测指标探讨不同温度、BLE灌注剂量以及二者的相互作用对小鼠泌尿生殖系统的影响。采用组织病理学方法,对小鼠卵巢和肾脏进行病理学观察,结果显示:,各组卵巢组织在14d时和28d时均未出现明显的病理变化,肾脏组织在14d时,NT+CON组和NT+BLE组肾脏组织未出现明显病理学变化;LT+CON组小鼠肾脏组织中出现肾小管上皮细胞肿胀颗粒变性,管腔内见嗜伊红蛋白沉积现象,LT+BLE组肾脏组织中肾小球和肾间质毛细血管扩张充血,肾小囊内见少量丝网状嗜伊红蛋白沉积。28d时,NT+CON组肾脏组织结构够完整,未见明显的病理学变化,NT+BLE组肾脏组织细胞中肾小管上皮细胞肿胀,颗粒变性,LT+CON组肾小管上皮细胞肿胀呈空泡状,且此状态细胞数目较多,LT+BLE组中肾小管上皮细胞肿胀程度较轻,且此状态细胞数目相对较少。采用流式细胞术对小鼠肾脏细胞凋亡率进行检测。结果显示,28d时BLE灌胃剂量水平对小鼠肾脏细胞凋亡率的影响达到极显著水平(P=0。004)。与CON组相比,BLE灌注组在14d和28d时肾脏细胞凋亡率上升,且上升幅度为14。94%。与CON组相比,BLE灌注组在14d时肾脏凋亡率有所上升,上升幅度为14。31%;在28d时,肾脏细胞凋亡率极显著上升(P=0。004),上升幅度为47。38%。研究结果表明,在低温条件下对小鼠灌注340mgkgBW的BLE最为符合实验理想条件。低温会导致小鼠泌尿系统出现损伤,对生殖系统影响不明显,灌注BLE能缓解损伤。根据本研究结果推测陕西佛坪大熊猫在冬季大量采食竹叶,可能有助于缓解其面临的寒冷胁迫,为探究其原因提供一种可能性。关键字:低温;竹叶提取物;小鼠;泌尿生殖系统AbstractInthisstudythemammaliankunmingmicewereusedasexperimentalanimalsBambooleafextractofBashaniafargesiiinfapingnationalnaturereserveofshaanxiprovincewasusedasexperimentalmaterialandtheexperimentalconditioweredifferenttemperaturesanddifferentoraldosesofbambooleafextract(BLE)。Basedontheestablishmentofbleexperimentalmethodologyunderdifferentenvironmentaltemperaturestheeffectsofbleontheurogenitalsystemofmiceunderdifferentenvironmentaltemperatureswereexploredwhichprovidedapossibilitytospeculatewhethertheforagingstrategyofgiantpandainthelongtermcoldenvironmentwasrelatedtothemetabolitesinbamboowhenitfacedbiologicalorabioticstressduringtheleaffeedingperiod。Content1EstablishmentofperfusionBLEexperimentalmethodologyatdifferentambienttemperatures60femalemicewererandomlydividedinto5groupsnormalcontrolgrouprespectively:NT+CON(25℃0mgkgBW)lowtemperaturecontrol:LT+CON(0℃0mgkgBW)lowtemperatureandlowdosegroups:LT+LBLE0℃(340mgkgBW)lowdosegroupof:LT+MBLE(0℃and680mgkgBW)andlowtemperaturehighdosegroups:LT+HBLE(0℃and1020mgkgBW)eachgroupof12cagefor2weeks。Content2EffectsofBLEontheurogenitalsystemofmiceunderdifferentambienttemperaturesDesignwith2×2factor(temperature:25℃4℃BLEinfusiondose:0mgkgBW340mgkgBW)theexperimentalgroupwasnormaltemperaturecontrolgroup:NT+CON。NormaltemperatureBLEperfusiongroup:NT+BLELowtemperaturecontrolgroup:LT+CONLowtemperatureBLEperfusiongroup:LT+BLEgroupwasdividedinto4groupseachgrouphad6replicateseachrepeathad10miceatotalof240mice。Theexperimentwasconductedinvivoforaperiodof28days。Theexperimentwasconductedintwostages14dand28d。TheeffectsofdifferenttemperatureBLEinfusiondoseandtheirinteractionontheurogenitalsystemofmicewereinvestigatedbypathologicaldiagnosiscellapoptosisandotherdetectionindexes。Histopathologicalmethodwasusedtomakepathologicalobservationontheovaryandkidneyofmice。Theresultsshowedthat:noobviouspathologicalchangeswereobservedintheovariantissuesofeachgroupatd14andd28andnoobviouspathologicalchangeswereobservedinthekidneytissuesofNT+CONgroupandNT+BLEgroupatd14。IntheLT+CONgrouprenaltubularepithelialcellswellingandgranulositydegenerationwereobservedintherenaltissuesandeosinophilicproteindepositionwasobservedinthelumen。IntheLT+BLEgroupglomerularandintetitialcapillarydilatationandhyperemiawereobservedintherenaltissuesandasmallamountoffilamentouseosinophilicproteindepositionwasobservedintherenalcapsule。NT28d+CONgroupofkidneytissuestructurecompleteenoughdidnotseeobviouspathologychangeNT+BLEgroupsofkidneytissueswellingintherenaltubularepithelialcellsgranulardegenerationLT+CONgroupofrenaltubularepithelialcellswellingvacuolatedandstateofthecellnumberismoreLT+BLEgroupsswellingintherenaltubularepithelialcellstoalesserdegreeandthecellnumberisrelativelysmall。Flowcytometrywasusedtodetecttheapoptosisrateofmousekidneycells。TheresultsshowedthattheeffectofBLEintragastinaldoseontheapoptosisrateofmousekidneycellsreachedanextremelysignificantlevelonday28(P=0。004)。ComparedwiththeCONgrouptherenalcellapoptosisrateoftheBLEperfusiongroupincreasedat14and28dandtheincreaseratewas14。94%。ComparedwithCONgrouptherenalapoptosisrateofBLEperfusiongroupincreasedat14dwithanincreaserateof14。31%。Atday28theapoptosisrateofrenalcellsincreasedsignificantly(P=0。004)withanincreaserateof47。38%。TheresultsshowedthattheBLEinfusionof340mgkgBWinmiceatlowtemperaturewasthemostsuitablefortheexperiment。Lowtemperaturecancauseinjurytotheurinarysystemofmicewhichhasnoobviouseffectonthereproductivesystem。PerfusionofBLEcanalleviatetheinjury。Accordingtotheresultsofthisstudyitisspeculatedthatgiantpandasinfopingshaanxiprovinceeatbambooleavesinlargequantitiesinwinterwhichmayhelprelievethecoldstresstheyarefacingandprovideapossibilityforexploringthecauses。KeyWords:LowtemperatureBambooleafextractMiceUrogenitalsystem。主要符号对照表符号中文含义英文含义BLE竹叶提取物BambooleafextractPSMs植物次生代谢产物PlantsecondarymetabolitesMDA丙二醛MalondialdehydeSOD超氧化物歧化酶SuperoxidedismutaseIFNγ干扰素γInterferongamma第1章前言1。1竹叶提取物的研究进展竹在我国分布广泛,种类繁多。可以作为建材、生活用品、工艺制品等,存在于人类生活的方方面面。除此之外,在《本经逢原》中有将竹叶入药的记载,能清热解毒[1]。近年来,对竹叶功效成分的研究越来越多,重点在于探究竹叶提取物的组成成分。相关研究表明,竹叶提取物的成分有:黄酮类[2]、酚酸类、蒽醌类[3]、萜类内酯[4]、生物活性多糖[5]、特种氨基酸[6]、芳香成分[7]等。此外,还含有锌、锰、硒等微量元素[8]。随着研究的不断深入,竹叶提取物的生理效应也逐渐被探索出来。竹叶提取物的主要生理作用有抗氧化[912]、清除自由基[1319]、调节血脂和血糖[2022]、抑菌[2326]、抗肿瘤[2732]等。1。1。1竹叶提取物抗氧化功效黄酮类化合物竹叶提取物主要成分之一,大量存在于植物中,毒副作用弱。因此,竹叶提取物具有良好的抗氧化和还原能力,能减少体内自由基的产生,加快自由基的清除速度,对自由基清除作用较强[33]。研究表明,黄甜竹、绿竹、毛竹、苦竹等的提取物都具有很好的抗氧化作用,能有效的清除机体自由基[34]。不同地区不同种类的竹叶在不同季节黄酮含量存在差异[35]。竹叶提取物在小鼠抗衰老试验中,能有效的提高过氧化物歧化酶的活性,降低内脂质过氧化,在体外试验中能很好的清除自由基,表现出有效的抗氧化能力[36]。不同竹种的竹叶提取物抗氧化功效表现出明显的不同,但都具有能抑制机体氧化应激反应的效果。1。1。2竹叶提取物抗炎抑菌作用大量研究表明,竹叶提取物对常见的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有很好的抑制效果[23]。抗菌实验表明不同竹种不同季节的竹叶提取物抑菌效果都不一样[37]。在小鼠气囊滑膜炎试验中,竹叶提取物对该炎症有抑制作用,表现出抗炎效果[38]。研究表明,竹叶提取物主要成分黄酮类化合物能刺激机体免疫细胞的的应答反应,促进增殖分化,分泌抗体,加强机体对炎症反应的抵抗[39]。对家禽生产性能的研究中发现,竹叶提取物能促进胸腺和法氏囊的发育,提高机体的免疫能力。1。2冷应激1。2。1冷应激对生物的影响动植物的生存都离不开一定的环境温度,舒适的温度能够使个体更好的生长发育和繁殖。环境温度的改变是一个很重要的环境应激因素[4041]。因此,环境温度直接影响着动物植物的生存状态。就人而言,长期处于冷应激环境中,机体稳态必然紊乱,出现各种不适症状,体温逐渐降低,慢慢丧失感觉[42],严重者便会威胁到生命。寒冷环境主要出现在冬季和高纬度地区,能存活在该条件下的生物必然具有很强的适应能力,从觅食策略到生活习性都能完美的契合生存条件,才不至于被寒冷环境淘汰。1。2。2冷应激对动物各组织的影响应激是机体受内外环境刺激所引起的内环境稳态发生改变的一种状态。应激根据应激源的不同分为冷应激、热应激以及运输应激等,其中对野生动物而言最常见的是以温度变化所引起的冷热应激,也是影响野生动物生活的主要因素。由寒冷刺激引起的冷应激可根据应激持续时间分为急性冷应激和慢性冷应激,其中急性冷应激是指机体短时间内处于低温环境;慢性冷应激通常是由于季节变化导致机体长时间处于低温环境中,导机体感觉神经核运动神经受到抑制,甚至可能发生不可逆损伤[43]。相关研究表明冷应激可引起炎症因子水平的上调,诱导炎症反应的发生,从而引起组织的炎性损伤。炎症反应是一种病理过程,是机体对刺激的一种防御性反应。Fu等发现12℃的冷应激可增加鹌鹑肠道NFκB的mRNA表达量,引发炎症反应[44]。68℃环境中连续冷应激3周可导致大鼠肠道上皮细胞增值率受损,诱导小肠发炎[45]。小鼠在4℃寒冷环境中冷应激2周后,也会发生炎症反应[46]。肉鸡在12℃冷应激条件下会导致肝脏组织的炎性损伤[47]。此外,冷应激还可以一起组织结构的病理学改变,导致组织的形态学损伤。李瑞纲等研究发现,昆明系小鼠每天在4℃环境中冷应激1h,连续30天后,其胃粘膜和肾上腺皮质区均出现出血点[48]。4℃和12℃的寒冷刺激可以引起915周龄雄性SD大鼠的脾脏形态学损伤,表现为白髓萎缩,淋巴小结减少[49]。在对肉鸡的研究中还发现冷应激可引起十二指肠组织的细胞核染色质边集、线粒体肿胀、内质网肿胀,甚至出现明显的细胞凋亡现象[50]。可以明显看出,冷应激会对动物机体产生不利影响,严重则可导致各组织出现不同程度的病理性损伤。冷应激对动物机体有着广泛且复杂的影响,就生产动物而言可以直接影响其生产性能、繁殖性能及产品质量,也会导致发病率和死亡率上升[5152]。有研究表明,冷应激可以对鸡、鹅[53]、鹧鸪[54]、猪[55]、牛[56]、羊[57]、小鼠[58]和大鼠[59]等的肠道、血清酶活力、精子活力、免疫系统、细胞核基因产生不同程度的影响,导致动物的生长、发育、繁殖、生活、行为等方面的异常状态[60],还会导致性发育迟缓、血液指标和代谢指标等不良反应,甚至在冷刺激达到一定程度时会致使动物发生关节炎、冻伤、肠炎、腹泻和肺炎等疾病,严重者直接导致动物死亡[61]。1。2。3冷应激对动物生殖器官的影响冷应激对生殖系统也有影响。动物实验显示,雄性长期暴露于冷环境中,其精子密度、精子活动率等显著下降,此外,D级精子比率显著上升,不仅如此,还会对精子的产生速度,睾丸中精子形态造成严重的影响[62]。低温对雄性大鼠有明显的抗生育效果[63]。雌性SD大鼠在冷应激两周后,健康的窦前卵泡、原始卵泡和初级卵泡的出现减少[64]。慢性冷应激能够引起卵泡发育改变而引起生殖损伤[65]。冷应激强度和冷应激频率对大鼠卵巢的黄体细胞与颗粒细胞分泌孕酮的能力也有影响[66]。持续冷应激可激活神经内分泌系统,通过影响下丘脑垂体性腺轴,使得雌性大鼠卵巢子宫发育延迟,卵巢重量、子宫重量及血清雌二醇水平显著下降,这些将进一步加重对生殖系统的影响。。。。
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