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探讨IL-17中和在自发性脑出血患者神经功能和神经干细胞定向分化的作用

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文档分类: 临床医学

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关于本文

  • 本文标题:探讨IL-17中和在自发性脑出血患者神经功能和神经干细胞定向分化的作用.docx
  • 链接地址:https://wk.sbvv.cn/view/16281.html
  • 内容摘要:探讨IL17中和在自发性脑出血患者神经功能和神经干细胞定向分化的作用目的自发性脑出血(sICH)是一系列严重的高起病率、高致死、致残率的脑血管事件。在实验动物模型和细胞水平上,最新研究发现IL17细胞因子与sICH的发病机制关系密切。此次研究的目的主要是阐明IL17对sICH患者的在神经功能的临床价值和作用机制。方法我们对45例重度脑出血患者以及45例正常健康人的血清IL17水平进行动态的检测,我们采用建立完善的临床量表对自发性脑出血病人的神经功能损伤程度和神经功能恢复的状况进行详细评估并打分。分别对不同分组的实验小鼠的神经功能损伤进行详细的分析和评价。在此同时,建立细胞再生体系共培养体系,根据组成成分不同将其分成三组,第一组是C培养体系第二组是C+TCRγδ细胞组,第三组是C+TCRγδ细胞+IL17中和组。最后我们通过相关实验仪器测试了Cs(神经干细胞)分化、nestin(巢蛋白)、GFAP(胶质纤维酸性蛋白)和MAP2(成熟神经元特异性标志物)的细胞存活率和不同的生物标志物。结果sICH患者血清中的IL17水平含量与自发性脑出血病人神经功能恢复相互之间呈显著负相关,(p0。001)。在细胞水平研究中,结果表明在细胞培养共同培养体系中,IL17中和可能会促进C的生存能力,这种C的生存能力将受到TCRγδ+共培养体系的影响(p=0。031),TCRγδ细胞共培养的条件下Cs存活率明显降低(p=0。023),差异有统计学意义,研究结果认为IL17中和提高C定向分化为星形胶质细胞,而不是定向分化神经元细胞。结论IL17作为一种促进炎症反应的细胞因子,这种细胞因子具有非常强烈的神经细胞毒性作用,这种神经细胞毒性作用显著影响着sICH患者的神经功能恢复状况。可能是由于IL17促炎因子抑制了C向功能神经细胞的分化从而影响病人预后的功能恢复。实验研究得出IL17中和的功能会削弱IL17促炎因子抑制作用,IL17中和不仅可以加强Cs的定向分化水平,并且可以显著的促进神经功能的恢复。关键词脑内出血;神经干细胞;白介素17;中和;定向分化AbstractObjectiveToinvestigatetheeffectofIL17onneuralfunctionandneuralstemcelldifferentiationinpatientswithspontaneousintracerebralhemorrhageObjectivespontaneousintracerebralhemorrhage(sich)isaseriesofseverecerebrovasculareventswithhighmorbiditymortalityanddisability。attheexperimentalanimalmodelandcelllevelrecentstudieshavefoundthatil17cytokinesarecloselyrelatedtothepathogenesisofsich。theaimofthisstudywasmainlytoelucidatetheclinicalvalueandmechanismofil17inneurofunctioninpatientswithsich。Methodsweperformedadynamictestofserumil17levelsin45patientswithsevereintracerebralhemorrhageandin45normalandhealthypatients。weusedawellestablishedclinicalscaletoevaluatethedegreeofneurologicalimpairmentandneurologicalrecoveryinpatientswithspontaneousintracerebralhemorrhageindetailandrated。Theneurologicaldamageofdifferentgroupsofexperimentalmicewasanalyzedandevaluatedindetail。AtthesametimethecellregeneratioystemcoculturesystemwasestablishedwhichwasdividedintothreegroupsaccordingtothecompositionthefitgroupwasCculturesystemthesecondgroupwasCTCR\947δcellgroupthethirdgroupwasCTCil17neutralizationgroupinr\947δcells。finallywetestedthecellviabilityanddifferentbiomarkeofcs(neuralstemcells)differentiationnestin(nestin)gfap(glialfibroacidprotein)andmap2(matureneuronspecificmarker)throughrelevantexperimentalitruments。ResultTherewasasignificantnegativecorrelationbetweeerumIL17levelsiICHpatientsandneurologicalrecoveryinpatientswithspontaneousintracerebralhemorrhage(p0。001)。theresultssuggestthatIL17neutralizationmaypromoteCviabilityincellculturecoculturesystemswhichwillbeaffectedbyTCRγδcoculturesystems(p=0。031)。ThesurvivalrateofCswassignificantlydecreased(p=0。023)undercocultureofTCR\947δcells。theresultssuggestthatIL17neutralizationenhancesdirectionaldifferentiationintoastrocytesratherthandirecteddifferentiationofneuro。ConclusioIL17asacytokinepromotinginflammatoryrespoethiscytokinehasaverystrongneurocytotoxiceffectwhichsignificantlyaffectstheneurologicalrecoverystatusofsICHpatients。probablybecauseIL17proinflammatoryfactoinhibitthedifferentiationofCtofunctionalnervecellsandthusaffectthefunctionalrecoveryofpatientprognosis。TheIL17neutralizingfunctioncanweakenIL17proinflammatoryfactorinhibitionIL17neutralizingcannotonlystrengthentheCsdifferentiationlevelbutalsopromotetherecoveryofnervefunction。[Keywords]Intracerebralhemorrhageneuralstemcellsinterleukin17neutralizationdirectionaldifferentiation探讨IL17中和在自发性脑出血患者神经功能和神经干细胞定向分化的作用1前言自发性脑出血(sICH)是一系列严重的高起病率、高致死、致残率的脑出血疾病的统称,一般由非创伤或者先天疾病因素导致,如高龄、高血压、血清胆固醇水平低、饮酒、颅脑血管畸形和吸烟及医源性用药等甚至不明原因。在中国这种病人的数量约占所有中风病人数量的8%15%,全世界范围内,在一些发展中国家如非洲或亚洲国家中自发性脑出血患者占中风病人的比重更高,而且往往导致意想不到的坏结果,自发性脑出血患者一个月的死亡率大约占30%55%,它往往导致较高的致残率及致死率,同时不幸的是超过30%的存活者遗留神经功能缺损[12]。近几十年来,随着医学科学技术的不断进步和发展,为了达到更好的治疗效果,如今医疗技术手段和治疗措施也在不断进步并且高超的技术和手段得到大规模推广和应用,目前全国范围内出现了大型的医疗机构急救中心,目的给了更快捷抢救病人,但是仅能有限的挽救生命或提高病患的生存率,在外科手术治疗方面,比如各种精细操作的开颅手术清除血肿,讲究显微操作小骨窗,起到了极少损坏责任血管或神经,但是经过人类共同的努力,目前仍缺乏有效的治疗方案和措施来降低sICH患者的致残及死亡率或改善脑出血患者的预后。尤其是那些从病理分类中的脑出血急性期幸存下来的患者,虽然生命保住了,可能会引发长期的认知及肢体活动功能障碍,这些预后不良的患者所带来的治疗和术后康复治疗费用,显然会加重家庭和社会的经济负担,与此同时,每况愈下的生活质量也给病人和家属带来心里压力和精神负担[3],因此为了挽救一个家庭,必须研究一种新的方法降低病死率成为医学界攻克的当务之急。一般情况下,sICH患者起病后患者通常会经历两个病理生理过程:第一个过程是原发性脑损伤,继而发生继发性脑损伤。原发性脑损伤通常在出血后的最初几分钟内发生。因为自发性脑出血患者短时间内扩大的血肿在这个阶段扮演者重要的角色[4],并且血肿量的大小和出血时间直接影响脑出血患者的预后效果包括认知及肢体活动功能,相比较而言,自发性脑出血患者出血时间越短,颅内血肿量越小,往往患者预后越理想,深究其原因,我们认为一定时间内的血肿增加量是导致sICH患者颅内压增高的最重要原因,血肿和颅内压关系可成正相关,随着单位时间内血肿腔的出血量增多,从而使得颅内压随之越高,经研究发现颅内压增高是岛之间sICH患者死亡的重要原因。MacLaughlin等[5]和Yuan等[6]在大量的研究中得出结论均显示颅内压检测仪,在临床治疗中监测患者颅内压,根据颅内压的大小的变化,调整脱水剂的使用量降低患者院内病死率起到了关键性作用。一般常见颅内压增高的因素有多种,其中小脑出血最常见的是由小脑占位性病变所致,随着时间变化,单位时间内血肿出血量的增加导致颅内压增高,造成患者意识上逐渐神智昏迷,最终患者死亡的原因可能是因为枕大孔疝的形成,相比于其他部位,如基底节出血,前者更容易致一定的致残率和致死率[78]。从病理学角度分析,以动脉壁发生病理生理改变为基础一般的血流动力学变化或其它诱因即可引起血管破裂此时血液从血管内溢出就引发了临床上常见疾病自发性脑出血自发性脑出血会导致正常脑组织及细胞损伤,形成一定空间的占位效应,当单位时间内出血量迅速增加就会导致其穿破了脑实质继而引发一系列的病症,如脑室蛛网膜下腔出血若脑出血量增多形成积血可以引起脑室被阻塞或脑表面被压迫,因此脑脊液循环受到影响。同理其占位效应和脑脊液循环受阻导致颅内压随之升高等颅高压到一定程度导致脑疝的发生,而固有颅内压的大小、脑出血伴发的损害、出血的速度和量对颅内压增高程度起着关键作用。脑出血时,在血流动力学压力和血肿压力趋于平衡、血管痉挛、凝血机制三者的共同参与下大约30min左右出血会停止大约6小时左右血肿不再扩大(头颅CT检查所示)。颅内压增高除引起导致脑疝的发生外,还可以直接损伤脑细胞以及使脑血管功能发生变化,例如使毛细血管和小静脉受压导致小静脉压升高、通透性增加最终血浆渗出发生组织水肿。一般在出血6小时左右头颅CT观察可见脑组织水肿水肿在34天时达到高峰。脑血管功能发生变化亦可发生于小动脉此时小动脉出现不同程度的狭窄引起脑组织发生缺血缺氧性改变从而加重组织损伤。小动脉功能改变所引起的脑组织缺血缺氧性损伤随着颅内压升高以及持续时间延长而逐渐加重与病灶距离越远的脑组织损伤越轻。然而,由于脑出血(STICH)的外科手术治疗并未能提供充足并具有说服力的证据来显示出早期手术切除血肿的疗效[9],所以研究者们的目光转移到了对继发性脑损伤的研究上来,以探索自发性脑出血的发病机制和治疗原则及策略为研究重中之重。sICH产生的继发性脑损伤可能的原因是由于脑实质内血液的存在而触发一系列的连锁反应,自发性脑出血后的脑内炎症反应主要表现为各种活化的炎症细胞的积聚。这些反应细胞释放炎症介质,包括趋化因子、细胞因子、蛋白酶和其他促炎分子。进而激活细胞毒性、兴奋性、氧化性和炎性途径等[1012]。由于血脑屏障(bloodbrainbarrierBBB)通常在sICH发病后被中断,在外周循环中的中性粒细胞和各种免疫细胞趁机在被破坏后的血脑屏障中逐渐浸润到大脑组织中去,相应引发脑内各种细胞产生一系列的连锁性炎症反应。因此,自发性脑出血患者局部的一系列的炎症反应通常起关键作用,并与sICH的病理过程和患者功能恢复有密切联系[1314]。在sICH患者所有治疗方案中,在有时效性的临床前试验中,证实Cs移植具有良好的治疗预后效果,试验证实Cs移植可以有效地促进神经干细胞的发育,从而改善脑卒中动物的神经功能缺陷,神经干细胞移植,它的特点是具有较强的自我更新和多向分化的能力,因此在sICH患者中把Cs移植作为一种潜在的治疗策略[15]。然而,Cs的作用机制,特别是Cs如何定向分化为某些特定的功能神经细胞,截止到目前临床实验验证中仍未得到明确的答案,Cs如何分化的机制一直是临床应用中需要及时解决的关键问题。由于sICH患者局部性和全身性发生着复杂的病理生理性及综合病变的改变,炎症相关的微环境与Cs的分化可能相互作用,进而进一步影响患者神经系统功能的恢复[1617]。一些白介素家族的细胞因子,包括IL1βIL6IL8andIL10,我们对这些细胞因子的发病机制的研究进行了深入的探索[18]。最近研究表明IL17,一种从TCRγδ细胞分泌的细胞因子,研究结果证实IL17这种细胞因子在动物实验模型与中风的发病机理密切的关联[19、20]。除此之外,基于当前的实验研究结果证明IL17中和在应用于某些中枢神经系统疾病有显著的治疗效果[17]。然而,IL17在sICH发病机制中神经功能恢复中的临床价值和作用机制一直是尚待解决的谜团。在本研究中,我们将首先探讨IL17在sICH患者中的临床价值,同时也继续深入探讨IL17在体内发病机制及体外神经发生中的潜在的影响及作用。研究方案本课题的研究分为两部分第一部分:首先采集重度自发性脑出血患者以及正常健康人血清标本,然后对人体血清中IL17水平进行动态的检测,通过检测自发性脑出血以及健康人群中血清IL17含量变化来比较两者之间的差异性,并且采用相对应的临床量表(包括GCS评分量表及GOS评分量表)对sICH病人的神经功能损伤程度以及神经功能恢复的状况进行详细评估。第二部分:从细胞水平,建立细胞模型分组,第一组是Cs培养体系,第二组是Cs+TCRγδ细胞培养体系,第三组是c+TCRγδ细胞+IL17中和培养体系,检测时间分别在24h72h内每隔24h测一次,运用蛋白免疫印迹技术,ELISA检测和CCK8检测TCRγδ细胞及IL17单抗于神经干细胞共培养对IL17表达影响,来探讨血清IL17细胞因子水平与临床病理特征之间的关联性,2材料与方法2。1临床资料我们收集样本的来源是从2017年1月至2018年3月份期间,从安徽医科大学第一附属医院神经外科并且所有患者均在症状出现后4小时内就诊于我院急诊科治疗的45例重度自发性脑出血患者,以及45例地域、年龄、性别相匹配的健康对照组,所有对照组都是从我院门诊体检中心筛选的健康人群,实验组及对照组之间的种族、地域、年龄、性别等人口统计学资料之间无明显统计学差异,所有这些患者均符合各种脑血管病诊断关键要点所述的ICH诊断标准。纳入标准如下:1、头颅CT(computedtomography)或者头颅MRI(MagneticResonanceImaging)提示颅内出血;2、至少3名5年以上从医经历的副主任医师诊断为出血性脑卒中;3、收缩压180mmHg,舒张压110mmHg。自发性脑出血的排除标准:1)因其他原因(经过全脑血管造影或脑血管成像检查等筛选化为不明原因)引起的脑内出血,2)由车祸或高处坠落伤导致的外伤性颅内血肿等外伤性的脑内出血性疾病;3)患者本身有严重基础疾病、比如严重慢性心肺功能疾病,循环和呼吸功能不稳定的患者24h内导致死亡、肾衰竭在透析过程的患者e、特发性血小板减少症患者、血友病患者等;4)由长期服用影响血凝机制的药物导致的脑内出血;比如长期服用三七、华法令房颤患者、长期服用阿司匹林凝血机制不良患者;5)患者既往有恶性肿瘤或良性肿瘤,行颅内肿瘤切除术后或自发性脑出血术后引发术区再次出血的患者等;6)患者有神经系统性疾病;健康组剔除标准;1)患有严重的免疫系统性疾病、恶性肿瘤、严重意识障碍等。2)患者有中枢神经系统和外周神经系统的疾病等。纳入原则:调查人员通过设计流行病学调查表进行流行病学调查,并详细记录所有纳入实验的患者样本临床流行病学资料,纳入的信息一般包含(性别及年龄)家族史、食物习惯、抽烟情况、长期高血脂情况、是否有饮酒情况、用药史(抗凝药物、抗血小板聚集药物)、长期的血压控制不佳、长期血糖控制不佳、颅内出血血肿大小、部位(位于幕上还是幕下)、血肿边缘距离皮层的多少、血肿压迫各脑室及脑池程度、中线移位程度、脑出血是否破入脑室、是否形成脑积水等。全部流行病学资料统计是由专职培训人员进行记录及汇总,目的保证资料的可靠性及完整性,参与本研究的自发性脑出血患者均提前告知其被纳入实验当中,所有患者和对照组均获得患者或家属知情同意。所有涉及人类参与研究的临床验证执行的程序均经中国安徽医科大学临床研究伦理委员会批准,且符合机构和国家的道德标准,并且按照《赫尔辛基原则宣言》开展进行的。纳入人群处理事项:这些样本收集的时间是从2017年1月至2018年3月份。并且所有患者均在症状出现后4小时内入院。然后在入院时(第1天、第3天、第7天和第14天)通过连续收集患者静脉血清样本。按照同样的收集方法,我们从对照组中收集健康人群静脉血清样本进行健康检查。所有血清样本需要通过专业操作者操作离心机分层后抽取上层淡黄色血清样本放入抗凝试管中,特别注意,所有经分离处理后患者的血清样本均储存于80℃。为了避免血清蛋白含量被降解,因此采集后所有患者血清样本尽量防止反复冻融,与此同时,我们采用格拉斯哥昏迷评分(GCS)对每位患者入院时的神经损伤程度进行评估并打分,入院后第14天的患者恢复情况我们采用格拉斯哥预后评分(GOS)对进行评估打分。两名以上10年以上从医经历的临床副主任医师采用盲法的方案对患者进行评估打分并取平均值。人血清采集处理方法:实验采用的真空采血管是含有EDTA抗凝剂,患者前臂静脉通常被选为穿刺部位进行采集样本,一般抽取前臂浅静脉血标本容量为510ml左右,采集完毕后小心轻放抗凝管,避免红细胞破裂溶解,用ELISA试验方法来检测人血清和不同共培养细胞组的IL17细胞因子的水平。2。2细胞水平实验方法:试剂选择除另有说明外,所有试验当中所需的试剂均为商业获得并严格按照规定使用。小鼠C系(NE4C)来自中国科学院细胞库(上海,中国)。抗体老鼠IL17A中和抗体都是从BD生物科学公司购买(美国CA)。抗小鼠GFAP抗体、抗小鼠MAP2抗体和抗小鼠nestin一抗WesteBlotting(蛋白印迹法)检测的主要抗体都是统一购自伊莱瑞特公司(武汉,中国)。用于人类和小鼠IL17A检测的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自瑞博奥公司(GA美国)。CCK8试剂盒购自美国西格玛公司。共培养体系1。细胞模型分组第一组是Cs培养体系,第二组是Cs+TCRγδ细胞培养体系,第三组是c+TCRγδ细胞+IL17中和培养体系,检测时间分别在24h72h内每隔24h测一次第一组是Cs培养体系小鼠神经干细胞NE4C细胞系的常规培养首先强调的是整个无菌操作都应该在酒精灯的周围,将细胞培养将小鼠神经干细胞冷冻后的NE4C细胞立即在37℃水浴中进行预处理,目的是将其缓慢解冻。然后将NE4C细胞放置在容量为2ml,含有1%抗青霉素链霉素双抗体,1%谷氨酰胺,1%非必需氨基酸,10%热灭活胎牛血清(FBS)的杜尔贝克改良的eagle培养基(DMEM),置于37℃、5%CO2、时间控制在20分钟,相对湿度为95%的适宜条件下的细胞培养箱中培养,分别经过将细胞复苏及换液后,传代培养于无菌培养瓶中(比例为1:2或1:3),加入培养基后继续培养或实验。第二组是Cs+TCRγδ细胞培养体系,细胞样本的制备:工作人员将生长状态良好的小鼠NE4C细胞接种于多聚赖氨酸包被的细胞培养板,待NE4C细胞完全贴壁后;正常对照组常规培养,实。。。
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