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miR-182、miR-183-5p和miR-96-5p与非酒精性脂肪肝的相关性研究

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文档分类: 药学论文

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关于本文

  • 本文标题:miR-182、miR-183-5p和miR-96-5p与非酒精性脂肪肝的相关性研究.docx
  • 链接地址:https://wk.sbvv.cn/view/17596.html
  • 内容摘要:miR182、miR1835p和miR965p与非酒精性脂肪肝的相关性研究摘要目的:非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)可加重代谢紊乱,增加相关并发症的发病风险。因此,早期发现NAFLD是避免并发症不良影响的关键。本研究旨在识别miRNAs,以早期诊断及治疗NAFLD。方法:1。动物实验:采用高脂饮食建立NAFLD大鼠模型。切取大鼠肝脏组织标本,检测肝组织甘油三酯含量,然后切取大鼠肝组织并使用HE染色和油红O染色观察其组织学改变。采用qRTPCR方法检测大鼠肝脏组织中miR182、miR1835p和miR965p的表达水平。2。临床实验:以健康人群和NAFLD患者为研究对象,从河北省人民医院体检中心收集研究对象血清,用qRTPCR方法检测研究对象血清中miR182、miR1835p和miR965p的表达水平并进行比较。结果:动物实验1。各组大鼠体重、肝湿重、空腹血糖、TG含量的比较HFD组大鼠体重、肝湿重高于ND组(P0。05)。TG含量在HFD组明显升高(P0。01)。两组中的空腹血糖未见明显差异(P>0。05)。2.肝脏组织病理学检测结果比较HE染色:ND组肝组织结构完整,未见明显炎症细胞和脂肪变性。HFD组肝小叶结构紊乱,肝细胞肿胀,肝细胞胞浆内可见大量脂滴空泡,气球样变明显,汇管区及小叶内可见大量炎细胞浸润。油红O染色:ND组未见明显脂滴积累,HFD组可见大量脂滴积累。3。各组大鼠肝脏miRNA的表达与ND组比,HFD组肝脏中miR182、miR1835P、miR965P表达明显减少,差异有统计学意义(P0。01);临床实验1。基本数据的比较获得了100名符合入选标准的参与者(50名男性,50名女性)的数据。收集以下指标进行比较:体重指数(BodyMassIndexBMI)、舒张压(DiastolicBloodPressureDBP)、收缩压(SystolicBloodPressure,SBP)、空腹血糖(FastingBloodGlucose,FBG)、尿酸(UricAcid,UA)、白蛋白(Albumin,ALB)、球蛋白(Globulin,GLB)、总蛋白(TotalProtein,TP)、总胆固醇(TotalCholesterol,TG)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、高密度脂蛋白(HighDeityLipoproteinCholesterol,HDLC)、低密度脂蛋白(LowDeityLipoproteinCholesterol,LDLC)。与健康对照组相比,NAFLD患者的BMI(P0。05)、DBP(P0。05)较高,NAFLD患者的血清中AST(P0。05)、ALT(P0。01)、TG(P0。01)、LDL(P0。05)、UA(P0。01)显著升高,HDL(P0。01)显著降低。2。血清microRNA测定结果与正常组(Normal)相比,mir182在非酒精性脂肪肝患者(NAFLD)的表达明显下降和减少差异具有统计学意义,差异有统计学意义(P0。05)。与Normal组相比,miR1835P在NAFLD组表达明显减少,差异有统计学意义(P0。05)。与Normal组相比,miR965P在NAFLD组表达明显减少,差异有统计学意义(P0。05)。结论:1。高脂饮食可以诱导大鼠肝脏脂肪变性。2。miR182、miR1835P、miR965p在脂肪肝组的大鼠肝脏中表达显著降低。3。miR182、miR1835P、miR965p在NAFLD患者的血清中表达显著降低,血清中miR182、miR1835p、miR965p可能成为筛查NAFLD新的标志物及潜在的治疗靶点。关键词:非酒精性脂肪肝;miR182;miR1835p;miR965pASSOCIATIONOFMICRORNAS(MIR182MIR1835PANDMIR965P)WITHNONALCOHOLICFATTYLIVERDISEASEABSTRACTObjective:ToinvestigatetherelatiohipbetweenmiR182miR1835pandmiR965pandnonalcoholicfattyliverdisease(NAFLD)andtoprovideastrongbasisfortheearlydiagnosisandtreatmentofNAFLD。Methods:1。Animalexperiment:Wistarratsattheageof7weekswererandomlydividedintocontrolgroup(ND)(n=8)andfattylivergroup(HFD)(n=8)afteradaptivefeedingforoneweek。LivertissuesampleswereremovedtodetecttriglyceridecontentandliverhistologicalchangeswereobservedbyHEstainingandoilredOstaining。TheexpressionlevelsofmiR182miR1835pandmiR965pinratlivertissuesweredetectedbyqRTPCR。2。Clinicalexperiment:SerumsofhealthypeopleandpatientswithNAFLDwerecollectedfromthePhysicalExaminationCenterofHebeiProvincialPeoplesHospital。TheserumlevelsofmiR182miR1835pandmiR965pierumofthesubjectsweredetectedbyqRTPCR。Results:Animalexperiment1。ComparisonofbodyweightwetliverweightfastingbloodglucoseandTGcontentsineachgroupThebodyweightandwetliverweightofHFDgroupwerehigherthanthoseofNDgroup(P0。05)。TGcontentinHFDgroupwassignificantlyincreased(P0。01)。Therewasnosignificantdifferenceinfastingbloodglucosebetweenthetwogroups(P>00。05)。2。ComparisonofliverhistopathologicalexaminationresultsHEstaining:IntheNDgroupthelivertissuestructurewascompletethelivercellswereneatlyarrangedtheliverlobuleswereregularandthecytoplasmwasuniform。Noobviousinflammatorycellsandsteatosiswereseen。IntheHFDgrouptheliverlobulestructurewasdisorderedthelivercellswereswollenalargenumberoflipiddropletswereseeninthecytoplasmofthehepatocytestheballoonlikechangeswereobviousandalargenumberofinflammatorycellsinfiltratedinportalareaandlobules。OilredOstaining:TherewerenoobviouslipiddropletsintheNDgroupandalargenumberoflipiddropletsintheHFDgroup。3。ExpressionofmiRNAinliverofratineachgroupComparedwithNDgrouptheexpressioofmiR182miR1835pandmiR965pinliverofHFDgroupweresignificantlydecreasedwithstatisticalsignificance(P0。01)。Clinicalexperiment1。ComparisonofbasicdataDatawereobtainedfrom100participants(50menand50women)whomettheinclusioncriteria。Wecomparedthefollowingindicato:fastingbloodglucose(FBG)uricacid(UA)albumin(ALB)globulin(GLB)totalprotein(TP)totalcholesterol(TG)triglyceride(TG)highdeitylipoproteincholesterol(HDLC)andlowdeitylipoprotein(LDLC)。ComparedwiththehealthycontrolgroupBMI(P0。05)andDBP(P0。05)werehigherinNAFLDpatients。SerumAST(P0。05)ALT(P0。01)TG(P0。01)LDL(P0。05)UA(P0。01)weresignificantlyincreasedinNAFLDpatientswhileHDL(P0。01)wassignificantlydecreased。2。SerummicroRNAassayresultsComparedwiththenormalgroup(Normal)theexpressionofmiR182wassignificantlydecreasedinthenonalcoholicfattyliverdiseasegroup(NAFLD)withstatisticalsignificance(P0。05)。ComparedwiththeNormalgrouptheexpressionofmiR1835pwassignificantlydecreasedintheNAFLDgroupwithstatisticalsignificance(P0。05)。ComparedwiththeNormalgrouptheexpressionofmiR965pwassignificantlydecreasedintheNAFLDgroupwithstatisticalsignificance(P0。05)。Conclusion:1。Highfatdietcaninducehepaticsteatosisinrats。2。TheexpressioofmiR182miR1835pandmiR965pweresignificantlydecreasedintheliverofratinthefattylivergroup。3。TheexpressioofmiR182miR1835pandmiR965pweresignificantlydecreasedierumofNAFLDpatients。SerummiR182miR1835pandmiR965pmaybecomenewmarkeandpotentialtherapeutictargetsforNAFLDscreening。Keywords:NonalcoholicfattyliverdiseasemiR182miR1835pmiR965p英文缩写ACRONYMNAMEINENGLISH中文全称NAFLDNonalcoholicfattyliverdisease非酒精性脂肪性肝病FBGFastingbloodglucose空腹血糖UAUricacid尿酸DBPDiastolicbloodpressure舒张压SBPSystolicbloodpressure收缩压ELISAEnzymeLinkedImmunoSorbentAssay酶联免疫吸附法BMIBodyMassIndex体重指数ALBAlbumin白蛋白GLBGlobulin球蛋白TPTotalprotein总蛋白TCTotalcholesterol总胆固醇TGTriglyceride甘油三酯HDLCHighdeitylipoproteincholesterol高密度脂蛋白LDLCLowdeitylipoproteincholesterol低密度脂蛋白循环MicroRNA(miR182、miR1835p和miR965p)与非酒精性脂肪肝的相关性研究前言NAFLD是世界范围内的一种常见的肝脏的疾病。NAFLD是由肝脏脂肪过度堆积引起的,没有其他明显的慢性肝病病因(如病毒性肝脏疾病或自体免疫性疾病)。在过去的二十年里,NAFLD的全球患病率从20%上升到30%[12]。肥胖症、胰岛素抵抗及高脂血症都与NAFLD有紧密的联系,可以增加心血管疾病、2型糖尿病及肝脏相关并发症的风险[3]。经人们研究发现环境及遗传性相关因素共同决定了NAFLD的表型并参与其发生发展,DNA甲基化、组蛋白修饰和microRNA调控属于与NAFLD相关的表观遗传变化,表观遗传学可以解释基因和外部影响之间的一些关系,有助于非侵入性生物标志物的发展[46]。MicroRNA(miRNA)是一种由20个左右的核苷酸组成的小分子RNA,这种内源性且非编码的小分子RNA有助于调控转录后水平上的基因表达。超过30%的人类信使RNA(mRNA)受到miRNA的调控,细胞凋亡、分化、增殖和代谢等多种生物学过程都与其有着密不可分的联系[78]。研究发现,特定组织的miRNA可以在血浆、血清、唾液、尿液、母乳和眼泪等多种体液中检测到[911]。循环mia可能受到外泌体、微泡和凋亡小泡的保护,并对RNase活性、极端pH值和温度都具有抗性,因此它在循环中是稳定的[1012]。许多研究都探讨了血清血浆miRNA作为NAFLD生物标志物的作用[1315]。早有研究报道了在日本中年NAFLD患者中血清miR21、miR34a、miR122和miR451水平升高,并且无论是男性还是女性NAFLD患者,血清miR122水平随着肝脏脂肪变性的加重而升高[15]。非酒精性脂肪肝患者大多无症状,多数是在做常规影像学检查时发现该疾病。一种潜在的检测方法是检测血清中与NAFLD发病机制相关的miRNA水平。候选miRNA包括miR182、miR1835P和miR965P,这些miRNA这些miRNA被证实与胰岛素抵抗及脂代谢相关[21617],所以miR182、miR1835P和miR965P可能在NAFLD发病机制中发挥关键作用。本课题首先通过高脂饮食喂养Wistar大鼠构建NAFLD模型,观察大鼠肝脏组织中miR182、miR1835P和miR965P与NAFLD的相关性;随后,我们进行了临床实验,我们研究了相同年龄段人群血清中miR182、miR1835P和miR965P的表达是否与NAFLD相关,以评估血清中miR182、miR1835P和miR965P的表达对肝脏代谢异常的意义。从而揭示NAFLD的部分发病机制及可能的治疗靶点,为临床诊疗提供新的理论基础和思路。材料和方法1材料1。1实验动物选用7周龄清洁级雄性Wistar大鼠,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,大鼠饲养于河北省人民医院临床研究中心动物实验屏障系统。屏障内环境:室温2025℃,相对湿度40%60%,12小时明暗周期。实验期间动物可自由摄食饮水。所有实验过程均通过河北省人民医院动物伦理委员会批准,并遵照河北省实验动物管理条例进行。1。2研究对象所有进行实验的血清样本均来自在河北省人民医院体检中心参与体检的人。排除其他全身性炎性疾病、急性呼吸道感染、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、酒精性肝炎或癌症患者。NAFLD患者诊断依据均符合中华医学会肝病学分会《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南(2010年修订版)》[18],该研究得到了河北省人民医院伦理委员会的批准,获得所有参与者的书面知情同意。1。3主要仪器仪器和设备型号产地台式离心机LDZ52型北京医用离心机厂冷冻高速离心机Fresco17Fresco公司电子秤JA3003上海精科天平电动匀浆器F610上海弗鲁克公司PCR仪ABI7500美国AppliedBiosyste公司石蜡病理切片机RM2245德国LEIKA公司冰冻切片机CM1950上海徕卡仪器有限公司低温冰箱(130)DW150W200青岛海尔特种电器有限公司低温冰箱(80)DW86L468青岛海尔特种电器有限公司超净台HFsafe1200力康发展有限公司离心管15毫升、50毫升美国Coing公司血糖仪稳豪型美国Roche公司1。4主要药品、试剂药品、试剂名称生产公司羧甲基纤维素钠北京Solarbio科技有限公司戊巴比妥钠粉剂进口分装,上海试剂采购供应站miRNA提取分离试剂盒北京天根生化科技有限公司miRNA逆转录试剂盒北京天根生化科技有限公司miRNA扩增试剂盒北京天根生化科技有限公司氯仿天津泰兴化学试剂厂无水乙醇天津泰兴化学试剂厂甘油三酯测定试剂盒北京普利莱基因技术有限公司油红O试剂盒南京建成公司苏木素伊红(H&amp;E)染色试剂盒北京索莱宝科技有限公司血糖试纸美国Roche公司2。方法1动物实验1。1动物模型的建立及分组研究使用7周龄雄性Wistar大鼠16只,体重在180200g,均购自北京维通利华实验动物技术有限公司(北京),饲养在河北省人民医院实验动物中心,实验前,大鼠可以随机进食标准食物和水一周。将大鼠随机分为2组:对照组8只(NC),热量配比:蛋白质20%,碳水化合物70%,脂肪10%,总热量为3。85kcalg,脂肪肝组8只(HFD),热量配比:蛋白质20%,碳水化合物40%,脂肪40%,总热量为4。49kcalg。饲料购自北京博奥派克生物科技有限公司。各组大鼠自由摄食饮水,每日记录摄食量,每周测量体重并记录变化情况。1。2。1血清标本采集大鼠禁食过夜,进行称重,然后以1%戊巴比妥钠60mgkg对大鼠进行腹腔麻醉,从腹主动脉取血,4℃低温3000rpm离心20min,收集血清,80℃保存备用。1。2。1肝脏组织标本采集腹主动脉取血后迅速取出肝脏,称取肝重。分装成数块肝组织,迅速放入液氮中,随后移至80℃低温冰箱中保存作为后续实验标本。切取部分肝组织置于10%中性甲醛液(PH=7。4)中固定用于苏木素伊红(H&E)染色。另取部分肝脏组织包埋于OCT(optimumcuttingtemperaturecompound)包埋剂中,保存于80℃低温冰箱中,制成冰冻切片用于油红O染色。1。3肝脏组织HE染色1、石蜡切片脱蜡至水:依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min二甲苯Ⅱ20min无水乙醇Ⅰ5min无水乙醇Ⅱ5min75%酒精5min,自来水洗。2、苏木素染色:切片入苏木素染液染35min,自来水洗,分化液分化,自来水洗,返蓝液返蓝,流水冲洗。3、伊红染色:切片依次入85%、95%的梯度酒精脱水各5min,入伊红染液中染色5min。4、脱水封片:切片依次放入无水乙醇I5min无水乙醇II5min无水乙醇Ⅲ5min二甲Ⅰ5min二甲苯Ⅱ5min透明,中性树胶封片。5、显微镜镜检,图像采集分析。1。4肝脏组织油红O染色1、新鲜冰冻切片固定:将冰冻切片复温干燥,固定液中固定15min,自来水洗,晾干。2、油红染色:切片入油红染液浸染810min(加盖避光),蒸馏水洗;3、背景分化:75%酒精稍分化,蒸馏水洗。4、苏木素染色:切片入苏木素染液染35min,自来水洗,分化液分化,自来水洗,返蓝液返蓝,流水冲洗。5、封片:甘油明胶封片剂封片。6、显微镜镜检,图像采集分析。1。5肝脏甘油三酯含量测定1)检测原理:脂肪酶分解血清中的甘油三酯为甘油;甘油激酶将甘油磷酸化为3磷酸甘油;3磷酸甘油被甘油磷酸氧化酶氧化产生过氧化氢;在过氧化物酶作用下生色底物转化为苯醌亚胺,其光密度值与甘油浓度成正比。2)操作步骤:①精确称重肝组织重量50mg,加入裂解液1mL,保证有效的匀浆裂解与脂质提取。用电动高速匀浆器破碎组织。匀浆后静置10分钟。②取适量上清液转移到1。5mL离心管中,进行以下步骤的操作。余下的裂解液可用BCA法蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。③70℃加热10min,组织量多时可能出现絮状沉淀。④室温2000rpm离心5min,上层清液即可用于酶学测定。⑤按4:1比例配工作液,取4ml试剂R1与1ml试剂R2混合,立即使用或4℃保存24h,变色弃去。⑥标准品稀释:用蒸馏水将4mM甘油标准品倍比稀释为1000、500、250、125、62。5、31。25、15。625、7。8125μmolL,通常取其中4~6管即可,注意设置0浓度对照反应管。⑦加样:空白管:。。。
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