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重组人粒细胞刺激因子原液车间设计

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文档分类: 化学论文

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关于本文

  • 本文标题:重组人粒细胞刺激因子原液车间设计.docx
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  • 内容摘要:重组人粒细胞刺激因子原液车间设计学院:材料与环境学院专业:生物工程姓名:学号:指导老师:职称:正高级工程师中国&#183;珠海二○二○年五月诚信承诺书本人郑重承诺:本人承诺呈交的毕业设计《重组人粒细胞刺激因子原液车间设计》是在指导教师的指导下,独立开展研究取得的成果,文中引用他人的观点和材料,均在文后按顺序列出其参考文献,设计使用的数据真实可靠。本人签名:日期:年月日重组人粒细胞刺激因子原液车间设计摘要重组人粒细胞刺激因子(recombinanthumangranulocytestimulatingfactor,rhGCSF)具有刺激中性粒细胞系增殖、分化和成熟以及激活血液中成熟中性粒细胞的功能,目前临床主要应用于抗肿瘤的放疗和化疗期间出现的不良反应,以及先天、后天中性粒细胞减少症。本文对重组人粒细胞刺激因子原液的生产工艺流程和内容进行研究,选取合适的生产工艺,根据生产要求确定与其相适应的设备,最终根据物料衡算确定设备参数进行设备选型,并结合GMP与制药行业标准对车间进行设计,绘制车间平面布置图。关键词:重组人粒细胞刺激因子;物料衡算;设备选型;车间设计WorkshopdesignofrecombinanthumangranulocytestimulatingfactotocksolutionAbstractRecombinanthumangranulocytestimulatingfactorhasthefunctionofstimulatingtheproliferationdifferentiationandmaturationofneutrophilsandactivatingthematureneutrophilsinblood。Atpresentitismainlyusedinantitumorradiotherapyandchemotherapyaswellascongenitalandacquiredneutropenia。InthispapertheproductionprocessandcontentofrecombinanthumangranulocytestimulatingfactotocksolutionwerestudiedtheappropriateproductionprocesswasselectedthecorrespondingequipmentwasdeterminedaccordingtotheproductionrequirementsandfinallytheequipmentparameteweredeterminedaccordingtothematerialbalanceforequipmentselectionandtheproductionworkshopwasdesignedincombinationwithGMPandpharmaceuticalindustrystandardsandtheworkshoplayoutwasdrawn。Keywords:recombinanthumangranulocytestimulatingfactormaterialbalancecalculationequipmentSelectionworkshopdesign目录1前言11。1粒细胞刺激因子作用机制11。2重组人粒细胞刺激因子的应用11。2。1肿瘤放化疗后的中性粒细胞减少11。2。2动员外周造血干细胞11。2。3辅助AIDS治疗21。3国内外研究现状和发展趋势21。4重组大肠杆菌高密度发酵31。4。1培养基31。4。2pH值31。4。3温度41。4。4溶氧41。4。5诱导方法41。4。6补料方法51。5层析技术51。5。1离子交换层析51。5。2疏水层析51。5。3分子筛层析51。6设计的目的和意义62工艺路线72。1重组人粒细胞刺激因子原液生产工艺72。2重组人粒细胞刺激因子生产流程简述72。2。1种子扩大培养及工程菌的发酵72。2。2重组人粒细胞刺激因子原液提纯82。2。3原液保存92。3小结103工艺计算123。1基础数据123。2生产过程中的物料衡算123。2。1培养基物料衡算123。2。2层析填料用量计算143。2。3缓冲液物料衡算153。3蒸汽用量183。4生产用水量203。4。1培养基及缓冲液配制用水量203。4。2发酵时的用水量203。4。3注射用水冷却时的用水量233。5工艺耗冷量243。6无菌空气244设备选型264。1种子培养间264。2发酵间274。3收获间284。4粗制间294。5精制间304。6灭菌间324。7小结335车间设计355。1车间布置355。2车间的压差分布376总结38参考文献39致谢41附录421前言粒细胞刺激因子作用机制粒细胞刺激因子(GCSF)是一种多肽糖蛋白,分子大小为20kDa。GCSF对中性粒细胞系的作用机制主要表现为:与粒系祖细胞特异结合时促进粒系祖细胞的增殖分化;与成熟中性粒细胞结合时增强中性粒细胞的趋化性、吞噬以及杀伤能力,对中性粒细胞进行调节,驱使中性粒细胞向血液释放;作用髓系造血细胞时,可以促进其增值、分化和成熟[1]。正常情况下,人体内的GCSF会维持在一个稳定的水平,但是在应激情况下,不仅被激活的巨噬细胞以及单核吞噬细胞产物作用下的内皮细胞可以产生GCSF,成纤维细胞与淋巴细胞被白细胞介素Ⅰ(InterleukinⅠILⅠ)刺激后也会产生大量GCSF,从而使中性粒细胞迅速从骨髓等储存池中补充,增强机体的抗感染能力[2]。重组人粒细胞刺激因子(rhGCSF)是通过基因工程技术,由大肠杆菌表达系统重组表达制备而成的分子大小为19kDa的无糖基化蛋白质,研究表明,在F60生物测定中有糖基化与无糖基化的GCSF都具有相同的生物学活性[3],即重组人粒细胞刺激因子与内源性的GCSF具有同等生物学活性。重组人粒细胞刺激因子的应用1。2。1肿瘤放化疗后的中性粒细胞减少在放化疗过程中使用的药物通常都是通过破坏DNA或抑制细胞周期来达到抗肿瘤的目的,会对骨髓细胞造成影响。在通常情况下,化疗效果与药物剂量成正相关,而药物剂量越大,骨髓抑制也就越严重,从而导致中性粒细胞减少,免疫力下降,感染并发症的概率大大提升,感染是各种癌症死亡的主要原因。除此之外,白细胞数目的减少使得内源性制热因子如肿瘤坏死因子的生成,导致患者体温升高,即发生中性粒细胞缺乏发热(FebrileNeutropeniaFN),FN患者感染并发症的概率远远高于普通患者[4]。rhGCSF在此可以起到预防中性粒细胞减少症的发生[5],减轻中性粒细胞减少的程度[6],缩短粒细胞缺乏症的持续时间,加速粒细胞的恢复,减少合并感染发热的危险性。除此之外,rhGCSF对于先天性的中性粒细胞缺乏患者也有很好的作用。1。2。2动员外周造血干细胞干细胞移植在医学上应用广泛,可以治疗多种疾病,如血液系统疾病、神经性疾病、代谢性疾病、自身免疫病以及缺血性疾病中。研究表明,GCSF可以增加外周血中造血干细胞祖细胞的数量,并且对骨髓细胞的动员是有特异性的[79]。rhGCSF作为动员剂在临床上已广泛应用,并且取得了很好的效果[10]。除了在中性粒细胞减少以及动员造血干细胞上rhGCSF以外,目前临床上还有很多新的应用,例如治疗急性脑梗死[11]、肝脏干细胞移植[12][13]。1。2。3辅助AIDS治疗HIV主要感染特异性免疫系统中的T细胞,导致免疫功能紊乱,但非特异性免疫系统的细胞如巨噬细胞和树突细胞等也受到感染。在艾滋病的病程中,中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞的数量和功能均发生病理改变。除此之外,艾滋病患者的免疫信号系统特别是细胞因子介导系统出现了重大缺陷,最终可能会引起免疫系统的崩溃。GCSF是免疫介质网络中的关键细胞因子,在一些国家中已经被证实用于治疗HIV感染者的中性粒细胞减少症[14]。中性粒细胞减少在艾滋病晚期很常见,通常由逆转录病毒感染、药物治疗、系统感染和自身免疫机制直接引起。对于艾滋病患者,中性粒细胞的凋亡和功能损伤会进一步加剧潜在的免疫缺陷并增加继发性或某些感染的风险。反过来,它们又与促炎细胞因子水平的增加和病毒血症、病毒复制的恶性循环有关。在临床中,GCSF联合抗生素或抗真菌治疗比任何一种单独治疗结果更好,HIV感染者中性粒功能缺陷通过体外注射GCSF得到改善或纠正。国内外研究现状和发展趋势自1985年科学家成功精制提纯出GCSF后,1986年成功克隆出GCSF基因,并在1990年克隆出GCSF的受体基因。为重组人粒细胞刺激因子的发展打下了坚实基础。1991年.Amgen公司的filgrastim(商品名:Neupogen,Gran)通过FAD的批准成功上市,Neupogen是全球首个通过基因重组技术生产的由大肠杆菌表达(不发生糖基化)的rhGCSF。国内首个上市的rhGCSF是由日本麒麟鲲鹏(中国)公司开发的在CHO细胞中表达(发生糖基化)的Lenograstim(商品名:Neutogin,Grancyte)。这两款均为短效GCSF药物。至今为止,我国国内生产短效GCSF的企业有近20家。2002年Amgen公司推出了长效型的GCSF,Neulasta(培非格司亭),这是全球首个PEG化的长效rhGCSF。与短效的GCSF相比,经过PEG修饰的GCSF药物半衰期大大延长,给药频率从化疗后的每天12次、给药514天,变成每个化疗周期注射一次,大大方便了患者使用,减轻患者痛苦,效果明显优于短效药。目前国内只有百克生物的津优力&#174;、齐鲁制药的新瑞白&#174;以及恒瑞的艾多&#174;。值得注意的是,键能隆创新药F627是第三代重组人粒细胞刺激因子药物,F627是重组粒细胞集落刺激因子的双分子(rhGCSFFc融合蛋白),与长效型GCSF相比更为强效。根据公司公告,该药品在澳大利亚完成的Ⅰ期临床试验中现实了良好的安全性和药代动力学特点;在国际多中心Ⅱ期临床试验显示该药的治疗效果与Neulasta相似,且半衰期比Neulasta略长;国内III期临床已取得阶段性进展,临床结果符合预期,有望成为我国第四个上市的长效GCSF。Amgen公司在1991年推出的短效GCSF在上市之后的20年里销售额稳定在10亿美元以上,近年因为长效化替代药和生物类似药Granix及Zarxio上市冲击市场份额减少,2017年销售额为3。86亿美元。Amgen公司推出的首个长效GCSF在上市后市场份额占比一路增大,在2015年达到47。15亿美元峰值,2017年市场占比达到89。2%。目前全球GCSF药物市场规模超过50亿美元,长效GCSF药物已成为市场主流,占比约为70%。从国内市场格局来看,整个GCSF市场销售额约为40亿元。随着2017年医保目录的调整,聚乙二醇重组人粒细胞刺激因子进入国家医保乙类目录以及2019年医保局发布《2019年国家医保药品目录调整工作方案》,国内长效GCSF进入快速发展期,短效GCSF为主导的局面将会被打破。重组大肠杆菌高密度发酵1。4。1培养基培养基是为微生物提供生长繁殖所需营养物质的微量元素的由人工配置的养料。一般的培养基都包含了碳源、氮源、无机盐和水,根据不同的微生物还会适当添加微量元素和维生素。有的培养基还会添加抗生素、激素或者血清。在大规模的发酵生产中,重组大肠杆菌的发酵普遍使用半合成培养基,如LB培养基和M9培养基。大肠杆菌高密度发酵中最常用的碳源是葡萄糖,除此之外还有糖类、油脂、有机酸和低碳醇。葡萄糖效应是使用葡萄糖作为碳源的一个弊端,会导致乙酸等代谢副产物的产生[15],在生产时需要控制葡萄糖的浓度。培养基添加的碳源分为有机碳源和无机碳源。与无机碳源相比,有机碳源有丰富的无机盐和生长因子。在使用有机碳源时,微生物往往会比用无机氮源生长旺盛,菌体浓度增长速度也比无机氮源快。工业上常用的有机氮源有:黄豆粉、酵母粉、玉米浆和酒糟等。值得注意的是,酸水解酪蛋白含氮量高达80%,还含有大量游离氨基酸和微量元素,应用于培养基中可缩短发酵周期,加快菌体的繁殖,增强蛋白质的表达,提高发酵中的产出率。微生物的生长代谢需要有无机盐的参与。无机盐的生理功能很多[16],如氯化钠可调节渗透压;镁离子是酶的激活剂;磷酸参与细胞代谢,参与细胞膜、蛋白质以及核酸的组成;铁离子参与电子传递,是多种酶的活性基团的组成部分;钾离子是某些酶的辅因子以及维持渗透压;锌离子可代替生长因子,刺激细胞生长。1。4。2pH值对于同一种微生物,不同的pH值可能会形成不同的产物。pH值会随着菌体的代谢活动产生有规律的变化。例如,培养基中碳源过多、菌体代谢产物为酸性物质、溶解氧不足、消泡剂添加过量等会导致pH值下降;当氮源过多、菌体代谢产物为碱性物质、或菌体发生自溶时,pH上升。大肠杆菌代谢副产物是乙酸,一般来说,当发酵液中的乙酸浓度在5到10gL时,可观测到乙酸对菌体的生长速率以及产物的抑制;当乙酸浓度大于10或20gL时,菌体停止生长;在生产实践中,发酵液乙酸浓度高于12gL时,会抑制外源蛋白的表达[17]。大规模工业生产中需要减少乙酸对产生,常采用的方法有控制生长速率、移去乙酸、控制葡萄糖浓度以及用碱中和pH。在大规模发酵中最常用的方法为碱中和法,此方法操作简单,成本低,对设备要求低。1。4。3温度大肠杆菌最适宜的发酵温度为37℃,在此温度下,大肠杆菌的比增长速率会增大。若温度过高,菌体代谢加快,副产物产生速率也会加快,导致代谢产物积累,对菌体的生长繁殖产生抑制,不利于目的蛋白的获取。菌体生长过快时,重组质粒的复制次数会增加,变异几率也会曾达,不利于质粒的稳定。若温度过低,菌体对营养物质的获取会减慢,新陈代谢减慢,减少了目的蛋白的合成。在工业生产中,为了保证产量,需要获得足量的菌体后再进行目的蛋白的诱导。1。4。4溶氧重组大肠杆菌是在有氧发酵条件下合成目的蛋白的,在大规模发酵中,通过搅拌的方式对菌体供给无菌空气,维持菌体的生长代谢。大肠杆菌的代谢与有氧呼吸有关,在对数生长期中DO明显下降,此时可以通过DO下降情况判断菌体生长情况。若菌体DO出现溶氧反弹后下降,可以判断菌体开始利用第二种基质,这在二次生长中非常常见。若菌体发生自溶,DO会上升。实际生产中DO并不是越高越有利,DO过高时,可能会形成超氧化物离子和过氧化物离子,会与H+结合生成H2O2,会与H2O2反应产生OH,破坏细胞组分[18]。工业上可以通过调节通气量以及搅拌速率间接调节菌体的发酵周期和代谢产物的合成。目前常用的调节溶氧的方法有改变通气速率;改变搅拌速率;改变发酵罐的罐压;改变发酵液的理化性质等。1。4。5诱导方法目前重组人粒细胞刺激因子生产中常用的诱导方法有高温诱导法和IPTG或乳糖诱导剂法[19]。高温诱导法是根据启动子在较低温度(37℃)时抑制,在较高温度(42℃)时开放的特点,通过升高环境温度对目的蛋白的表达进行诱导。但在高温下,菌体代谢速率加快,会引起代谢副产物乙酸的积累,抑制目的蛋白的表达。IPTG诱导剂可以与启动子的阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白从启动子上解离,启动转录,IPTG是一种很稳定的诱导剂,不会被细菌代谢。除此之外,还可以使用乳糖代替IPTG作为诱导剂,细胞内的β半乳糖甘酶把乳糖转化成异乳糖,异乳糖具有诱导作用,但乳糖的转化较为复杂,与IPTG相比,乳糖的诱导效率大大低于IPTG。除此之外乳糖是一种可以被大肠杆菌利用的碳源,若乳糖过多可能会对菌体的代谢产生不好的影响。1。4。6补料方法为了防止高糖条件下产生葡萄糖效应,影响目的蛋白的合成,工业上通常会合理控制流加营养物。大肠杆菌高密度发酵中最常用的补料方法是分批补料法,按照流加方式不同,分为反馈补料和非反馈补料。反馈补料主要是通过检测发酵液的pH、溶氧、菌体浓度和二氧化碳释放率等参数,来调节补料的速度。非反馈补料法主要有恒速补料、变速补料以及指数补料等技术,恒速补料的流加速度恒定,菌体比生长速率随时间增长而下降;变速补料在高密度发酵下可以促进细胞增长,有利于产物表达;指数流加可以减少代谢产物如乙酸的生成。层析技术1。5。1离子交换层析离子交换层析时利用蛋白质表面所带电荷的不同,让蛋白质可逆的结合在离子交换剂上,用不同pH值或离子强度的缓冲液洗脱,结合在离子交换剂上的蛋白质与缓冲液中的离子发生交换,从而脱离离子交换剂被洗脱到溶液中。不同物质与离子交换剂结合的能力不同,洗脱顺序也不一样,从而达到分离的目的。离子交换层析一般用于多肽的分离、蛋白质的分离,核苷酸、核苷和各种碱基的分离。重组人粒细胞因子(pI5。86。6)在缓冲液(pH4)中带正电,应选用阳离子交换剂。1。5。2疏水层析盐水体系中不同蛋白质分子的疏水基团与层析介质的疏水配基之间结合的作用力强弱不同,疏水层析利用这两者的差别来达到分离的目的。蛋白质经过变性或在高盐的环境下,蛋白质的水化层被破坏,疏水残基暴露于表面。样品经过变性或高盐处理后进行疏水层析,离子强度从高到低的洗脱液可以把疏水作用由弱到强的组分分开,且蛋白质样品依旧保留生物学活性。因疏水层析操作成本低且产物有活性,在工业生产中得到广泛应用,一般用于可以将蛋白质初步的分离,用于盐析之后的蛋白质进一步提纯。1。5。3分子筛层析分子筛层析又叫凝胶过滤层析或排阻层析,由于不同的蛋白质分子形状和大小不同,进入特定大小孔径的凝胶颗粒得到能力也不同,分子量大的蛋白因不能进入凝胶内部首先被洗脱,分子越小在凝胶内部的滞留的时间越长,越晚被洗脱,从而完成分离。一般应用在分离纯化、脱盐以及相对分子量测定。设计的目的和意义据2018年全球癌症年报统计数据显示,2018年全球预计有1810万癌症新发病例,亚洲占比近50%。全球死亡病例高达960万,亚洲则占了近60%的比例。2018年我国癌症新发病例为380。4万例,死亡病例229。6万,在癌症发病率和死亡率不断上升的情况下,当前中国的癌症发病人数和死亡人数均位居全球第一[20]。从第五届全国艾滋病学术大会上传出的数据,“2018年第2季度,中国新发现艾滋病病毒感染者和艾滋病人40104例,其中性传播占93。1%。”艾滋病人基数在逐年增加,最近几年,我国每年报告新发现HIV感染者AIDS病人均超过10万例,且一年多于一年,至2018年6月30日,全国报告现存活艾滋病人和感染者超过82万人[21]。数据表明,我国对重组人粒细胞刺激因子注射液的需求逐年上升,并纳入了医保范畴,随着技术的发展和研究的深入,重组人粒细胞刺激因子有了更多方面的应用,通过分子修饰等手段逐渐改变原有的缺点。因此,重组人粒细胞刺激因子原液车间的设计是很有必要的。国内有着成熟的重组人粒细胞刺激因子原液的生产工艺,在研发创新上也有属于自己的产品,增加重组人粒细胞刺激因子注射液的产量,提高产品质量等对我国的医疗市场有重大意义。2工艺路线2。1重组人粒细胞刺激因子原液生产工艺目前市场上的重组人粒细胞刺激因子都是通过液体培养基中大规模发酵培养能表达GCSF的大肠杆菌[22],得到含有重组人粒细胞刺激因子的不溶性包涵体,经过变性复性处理恢复其生物学活性得到重组人粒细胞刺激因子原液[23]。其生产过程可分为:种子扩大培养及工程菌的发酵以及重组人粒细胞刺激因子原液的提纯两个阶段。2。2重组人粒细胞刺激因子生产流程简述2。2。1种子扩大培养及工程菌的发酵2。2。1。1一级种子液的获取把冻存的种子液解冻后(100μL)接种到含有160ml的LB培养基的250ml摇瓶中,37℃&#177;1℃、pH6。8&#177;0。2,转速200rmin,使用摇瓶进行一级种子培养8小时。LB培养基配方为:蛋白胨5gL,酵母粉10gL,氯化钠5gL。2。2。1。2二级种子液的获取培养基进行实罐灭菌后开启发酵罐搅拌装置,采取自然冷却,待培养基冷却到50℃时开始通入无菌压缩空气并继续搅拌,确保发酵开始时有一定的氧含量。按照1%的接种量把一级种子液接种到含有16L的LB培养基的20L种子罐中,37℃&#177;1℃、pH6。8&#177;0。2,转速500rmin,通气比1。3vvm,使用种子罐进行二级种子培养8小时。种子液配方为:蛋白胨5gL,酵母粉10gL,氯化钠5gL。2。2。1。3工程菌的发酵培养基进行实罐灭菌后开启发酵罐搅拌装置,采取自然冷却,待培养基冷却到50℃时开始通入无菌压缩空气并继续搅拌,确保发酵开始时培养基有一定的氧含量。把二级种子液按照10%的接种量接种到含有104L培养基的200L发酵罐中进行分批流加补料发酵,发酵所需空气来自经过空气过滤器除菌的压缩机,发酵温度为37℃&#177;1℃,DO为5060%,pH7。0&#177;0。2,转速700rmin,通气比1。3vvm。发酵过程中使用氨水调节pH值,加入消泡剂消泡。每小时取样测OD600,进入对数生长期后,每隔1小时分批流加补料液,每次10L,共流加40L,OD6002。5时加入7mmolLIPTG诱导表达。种子放大后进入发酵罐发酵时间约为24h。发酵液配方为:蛋白胨5gL,酵母粉10gL,氯化钠5gL,酸水解酪蛋白5gL,氯化铵1gL,磷酸二氢钾5gL,Na2HPO4&#183;12H2O18gL,硫酸镁0。5gL,氯化钙0。5gL,微量元素母液1mlL。微量元素母液:ZnCl2&#183;4H2O2gL,CoCl2&#183;6H2O6gL,FeSO4&#183;16H2O4gL,H2BO35gL,MnCl2&#183;4H2O1。6gL。补料配方为:蛋白胨25gL,酵母粉50gL,葡萄糖25gL,氯化钠5gL。2。2。2重组人粒细胞刺激因子原液提纯工艺中所使用的10m。。。
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