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• 本文标题：Wnt4重组蛋白对鸡等级卵泡颗粒细胞相关基因表达的影响.doc
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• 内容摘要：Wnt4重组蛋白对鸡等级卵泡颗粒细胞相关基因表达的影响 摘要 卵泡选择与产蛋量高度相关研究卵泡选择的分子机制可为提高其产蛋性能提供一定的理论依据。信号通路能够调控很多卵巢生长发育过程中的生理过程，如卵泡发育排卵和黄体化。为了研究检测了。本研究的结果可为研究的具体功能提供一定的基础，也可为进一步阐明鸡卵泡选择的分子机制提供参考。 关键词，鸡，卵泡选择，信号通路，，qRTPCR EffectofWnt4RecombinantProteinonExpressionofGenesRelatedtoGranulosaCellsofChickenhierarchalFollicle ABSTRACT Ovarianfollicleselectionisanimportantprocessimpactingthefecundityofhe。Studyingthemolecularmechanismoffollicleselectioncanprovideatheoreticalbasisforimprovingeggproductionperformance。Wntsignalingpathwaycanregulatemanyphysiologicalprocessesduringovariangrowthanddevelopmentsuchasfollicledevelopmentovulationandluteinization。Wnt4isamemberoftheWntfamilyitplaysaregulatoryroleinthereproductivesystemoffemaleanimals。InordertostudytheeffectofWnt4onfollicleselectionthisstudyexaminedtheeffectofWnt4recombinantproteinontheexpressionofrelatedgenesinchickenhierarchalfolliclegranulosacells。TheresultsshowedthatWnt4recombinantproteincouldsignificantlyincreasedtheexpressionofFSHRandCTNNB1italsocouldpromotetheexpressionofStARandCYP11A1。TheresultsofthisstudycanprovideacertainresearchbasisforthestudyofthefunctionofWnt4andalsoprovideareferenceforfurtherelucidatingthemolecularmechanismofchickenfollicleselection。 Keywords，ChickenollicleselectionWntsignalingpathwayWnt4qRTPCR 目录 目录 1。文献综述 1 1 1。1。1卵泡发育 1 1。1。2卵泡选择 1 1。2信号通路 2 1。2。1信号通路简介 2 1。2。2家族成员在卵泡发育中的作用 2 1。3 2 1。3。1Wnt4简介 2 1。3。2 2 1。4本研究的目的及意义 3 2。材料和方法 3 2。1实验材料 3 2。1。1实验动物 3 2。1。2实验器材 3 2。1。3实验试剂 3 2。2实验方法 3 2。2。1鸡卵泡颗粒细胞的培养 3 4 2。2。3鸡卵泡颗粒细胞的RNA提取 4 2。2。RNA反转录后进行qRTPCR检测 4 2。3数据统计分析 6 3。结果 6 参考文献 8 10 1。文献综述在中，处于比较重要的地位[]。生产周期短饲料转化率高投资少随着社会经济的发展，人们的生活水平有了很大的提高，对食物的要求也提高。制约鸡产蛋量的关键因素卵泡选择和卵泡发育因此研究卵泡的选择和发育机制显得尤为重要本研究主要检测了4重组蛋白对鸡等级卵泡颗粒细胞相关基因表达的影响，可为阐明也可为提高鸡的产蛋性能和繁殖力提供一定的理论参考。鸡作为类的一种，以卵生的方式繁衍后代，因此卵巢功能的正常执行是其卵泡生长发育和排卵等一系列生殖行为的基础。鸡卵巢是一个不断发生规律性变化的器官，是雌性生殖系统中重要的结构器官，同时也是一种必需的内分泌器官，这对于卵巢排卵和卵泡增长具有重要意义[2]。鸡以特定节律，24h左右，排卵，而且在母鸡腹部内存在不同阶段的卵泡，卵生动物最重要的繁殖特点就是卵泡等级制度，这是包括他们远古祖先在内所有卵生动物的共同特征[3]。1。1。1卵泡发育 ，且受到各种分泌因子的调控[4]。1。1。2卵泡选择 [5]。抗穆勒氏管激素在产蛋的峰期，母鸡以特定节律从小黄卵泡中选择一个进入等级卵泡，迅速生长繁衍，这个过程就称为卵泡选择[5]。[6]。小白卵细胞会发育成小黄卵细胞，在这个过程中小黄卵细胞池中被不断地填补进被生长激活后的小白卵细胞。在鸡的卵巢中未被选择的小黄卵细胞并不会失去活性，这与其他的哺乳动物并不一样，未被选择的小黄卵细胞会供给下一个周期，重新经历一遍选择过程[7]。在一个发育完善的鸡卵巢中，只有几百个卵母细胞能发育成熟并被排出，这是在巨大的12000个基数情况下，剩下的卵母细胞就会失去发育能力，因此研究卵泡选择的分子机制对于充分开发禽类卵巢中的卵泡资源十分重要。 1。2Wnt信号通路 1。2。1信号通路简介 蛋白家族，由[8]。经典型Wnt蛋白与低密度的跨膜蛋白结合，非经典Wnt蛋白不依赖β连环蛋白的转录功能。Wnt信号通路可以调节控制机体疾病的发生和发育过程，是调控细胞增殖分化的关键环节[]。s在一般情况下，作为配体来参与信号转导，有15种或更多的受体或者协同受体来相互作用，它们的相互作用可以引发三种不同的信号转导[10]。 1。2。2家族成员在卵泡发育中的作用 信号通路有助于卵巢和卵泡的发育。家信号通路能够参与多种生理过程，如胚胎的生长发育排卵和代谢[]。信号失调，从而导致基因表达过量，可能会引起基因突变，产生疾病[]。信号通路可以阻碍脂肪细胞分化，此外信号通路还可以控制细胞的增值和凋亡。具有比较高的保守性，可以参与体内多种发育过程[1]。[14]。针对的功能研究发现，鸡卵泡的选择与发育与[15]。 1。31。3。1Wnt4简介 [18]。Wnt4有研究证明其在人类和小鼠的早期胚胎发育中起着关键作用[16]。Wnt4可以调控胚胎卵巢的发育和分化，在哺乳动物的小卵泡中高度表达，此后逐渐减少，直到排卵[17]。在小鼠中，Wnt4参与了卵巢的发育生长和成熟，也可以调控雌性动物的性腺分化。Wnt4还能调控人的黄体化颗粒细胞中相关基因的表达。 1。3。2Wnt4在卵泡发育中的作用 Wnt4对雌性动物生殖系统的发育起关键作用[19]。目前，人们对的注意力主要集中在对哺乳动物，尤其是人和鼠，上，尤其是[20]。[21]。鉴于Wnt信号通路的保守性，我们猜测，Wnt信号通路也能够参与禽类的卵泡发育，[22]。 1。4本研究的目的及意义 可为进一步明确卵泡选择的分子机制提供一定的参考，在提高家禽经济效益上起到极其重要的作用[]。 2。材料和方法 2。1实验材料 2。1。1实验动物 随机选取三只200日龄处于产蛋高峰期的母鸡，海兰褐壳蛋鸡，及时处死，取其所有卵泡按标准分好等级，用于培养卵泡颗粒细胞。2。1。2实验器材 超低温冰箱低温高速离心机荧光定量PCR仪PCR仪稳压电泳仪凝胶成像系统超净工作台电子天平制冰机高压蒸汽灭菌器二氧化碳培养箱微量高速离心机移液器电热恒温鼓风干燥箱正置照相显微镜细胞低速离心机超纯水机细胞培养板等实验耗材。 2。1。3实验试剂 M199培养基，胰酶，胎牛血清，青链霉素，Trizol，氯仿，异丙醇，75%乙醇，RNaseFreeH2O，DNAmarke，SYBRPremixExTaqII定量试剂盒，反转录试剂盒，II型胶原酶，胎牛血清，青链霉素，PBS等。 2。2实验方法 2。2。1鸡卵泡颗粒细胞的培养 ，1，产蛋高峰期母鸡，使用颈静脉放血的方式杀死，消毒的小剪刀完整取下卵巢用消毒的大剪刀剖开腹部，投入盛有3%青链霉素PBS，实验前注意进行灭菌，的无菌大烧杯中，进入无菌间完成分离。注取卵巢时应注意保持卵泡的完整。 ，2，选择直径mm以上的各级卵泡，逐个取下放于盛有3%青链霉素PBS的灭菌平皿中，在超净工作台中，用左手拿尖头镊子，右手用尖头镊子将卵泡的外层膜挑开进行剥离，剥离后暴露基膜层，用尖头镊子剪破基膜层放出卵黄，为了免损伤颗粒层，在释放卵黄时动作的一定要轻柔，颗粒层中可能带有卵黄，为减少卵黄的含量可以洗涤几次，释放出卵黄后，将基膜层和颗粒层进行分离，分离后颗粒层放入盛有3%青链霉素PBS的烧杯或培养皿中。 ，3，向颗粒细胞层中加入适量，实验前检测要确定其无污染，，放入恒温37℃的CO2培养箱中进行培养，处理。 ，4，颗粒层处理好后加入PBS终止，1800rpm离心5min弃去上清，加PBS吹洗，1800rpm离心5min，弃去上清。 ，6，根据沉淀多少用适量新的培养液把离心管底部的细胞沉淀进行重悬，在24孔板中先加入少量培养液，200ul，第一列四个孔即可，，然后每孔加入100uL，150uL，200uL，250uL重悬的细胞于24孔板第一列的四个孔中，用显微镜进行观察，选择适宜的细胞密度进行后续的布板。 ，7，每孔中加入适量的细胞悬液，用新的培养液补足充至1000uL，将接种好的板轻轻放入恒温37℃的CO2培养箱进行培养，CO2浓度为5%。 ，8，接种后12h进行换掉部分培养液液，培养24h左右换掉全部培养液，注意换液时用PBS进行清洗，清洗动作轻柔，防止细胞贴壁不紧而导致细胞大量流失。 ，9，培养到细胞贴壁85%左右用于后续实验。向不同孔的颗粒细胞中分别添加不同的 2。2。3鸡卵泡颗粒细胞的RNA提取 本实验使用Trizol法提取总RNA，详细操作步骤如下， ，1，用PBS清洗两次准备提取RNA的细胞，将1mLTrizol加入培养板的孔中，用移液器吹打，将细胞裂解下来，转移到新的1。5mL的离心管中，置于冰上充分裂解12min左右。4℃，12000rpm，离心90s左右。将适量上清液转移至新的离心管中，避免吸取沉淀，。 ，2，向离心管中加入200μL氯仿，用力摇匀，置于室温，1530℃，静止5min， ，3，4℃12000rpm离心15min，管中的液体将分为三层，上层清澈，中间为白色沉淀，下层红色，将上清转移至一个新的离心管中。吸取上清大约为450uL，注意吸上清尽量不要太多，以免吸到蛋白质，污染RNA。 ，4，向取得的上清液中加入500uL冰异丙醇，缓慢上下颠倒离心管直至充分混匀，置于冰上10min，沉淀RNA，4℃12000rpm离心10min，弃上清。 ，5，向沉淀中加入600uL70%乙醇，轻微振荡，4℃12000rpm离10min，洗涤RNA，吸出上清。 ，6，打开离心管盖，晾干残存的乙醇，约35min后加入50μLRNaseFreeH2O溶解，于80℃冰箱内分装保存，备用。 ，7，RNA质量及浓度检测，电泳检测RNA的质量和浓度，并用紫外分光光度计检测A260A280A260A230的值。 2。2。RNA反转录后进行qRTPCR检测 ，1，反转录合成cDNA，cDNA的合成按照TakaRa公司反转录试剂盒的操作步骤进行详细步骤如下， Ⅰ基因组DNA的去除反应 按21配成反应体系，置于金属浴中，程序为，42℃2min，4℃保存。 Ⅱ反转录反应 按表22配成PCR体系，置于PCR仪中进行反转录，程序为，37℃15min，85℃5s，最后于20℃保存。 表21DNA去除反应体系组分 组分Element 体积Volume(μL) gDNAEraser 1 5×DNAEraserbuffer 2 TotalRNA 1 RNasefreedH2O Upto10 表22反转录反应体系组分 组分Element (μL) RNasefreedH2O 4 5×PrimeScriptbuffer 4 RTPrimerMix 1 PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ 1 运用PrimerPremier5软件，按照qRTPCR引物设计原则，设计荧光定量PCR引物，引物由上海生工生物有限公司合成。 在荧光定量PCR仪上进行基因mRNA表达水平检测。各cDNA以βactin为持家基因进行相对定量PCR反应。反应体系见表23。荧光定量引物见表24。每个样品重复三次。PCR采用两步法，反应条件为，95℃预变性30s，95℃5s，60℃20s，循环数为40，解曲线，95℃s，65℃15s，95℃s。同时将各个样品的cDNA取出等量混池，并以此为模板进行2倍梯度稀释，以持家基因和目的基因特异性引物来进行扩增，建立标准曲线。最后用2Ct的方法算出基因的表达水平[23]，确定基因的相对表达量。 表23qRTPCR反应体系组分 组分Element (μL) SYBRPremixExTaq(2×) 10。0 cDNA 1。5 Primer1 0。4 Primer2 0。4 ddH2O Upto20 表24荧光定量PCR引物 Gene 登录号 AccessionNumber (GenBank) 引物序列 PrimerSequence 产物长度 ProductSize FSHR NM_205079。1 Forward:5TTCCAGCCTTCCCAAACTA Revee:5GCCGTAGAATCACACTTTCAG 258bp StAR NM_204686 Forward:5TGCCTGAGCAGCAGGGATTTATCA Revee:5TGGTTGATGATGGTCTTTGGCAGC 149bp CYP11A NM_001001756 Forward:5ACTTCAAGGGACTGAGCTTTGGGT Revee:5AGTTCTCCAGGATGTGCATGAGGA 103bp CTNNB1 NM_205081。1 Forward:5GTCTCCATTACGGACTCCCA Revee:5CAAACTGCTGTTGCGTTCCACCCAT 220bp ACTB K02173。1 Forward:5TGGATGATGATATTGCTGC Revee:5ATCTTCTCCATATCATCCC 253bp 2。3数据统计分析 所有数据均用IBSSPSSStatistics21分析，结果用平均数±标准误表示，不同组之间利用单因素方差ANOVA和邓肯式检验进行，结果均以P0。05为差异显著。 3。结果 Wnt4重组蛋白能够上调 参考文献 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