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• 本文标题：干旱胁迫及复水处理下寒富苹果叶片的生理响应及转录组分析.doc
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• 内容摘要：干旱胁迫及复水处理下寒富苹果叶片的 生理响应及转录组分析 目录 摘要 1 ABSTRACT 3 第一章前言 4 1。1聚乙二醇模拟干旱胁迫对植物的影响 4 1。2干旱对植物的影响 5 1。3植物对干旱胁迫的生理响应机制 5 1。3。1干旱对植物光合作用的影响 5 1。3。2干旱对植物活性氧及抗氧化酶的影响 6 1。3。3干旱对植物渗透调节物质的影响 6 1。4干旱胁迫后复水对植物生理生化指标的影响 7 1。5干旱胁迫下植物转录组测序的研究进展 7 1。6本研究的目的与意义 9 第二章材料与方法 11 2。1试验材料 11 2。2试验处理 11 2。2。1PEG模拟干旱胁迫处理 11 2。2。2自然干旱处理 11 2。3试验方法 11 2。4转录组分析 12 2。4。1cDNA文库构建测序和分析 12 2。4。2序列拼接和基因功能注释分析 12 2。4。3GOKEGG富集分析 12 2。4。4基因差异表达分析及共表达基因聚类分析 13 2。4。5实时荧光定量PCR 13 2。5数据分析 14 第三章结果与分析 15 3。1寒富苹果叶片对PEG处理的生理响应 15 3。1。1PEG处理下寒富苹果叶片水势测定 15 3。1。2PEG处理下寒富苹果叶片叶绿素测定 15 3。1。3PEG处理下寒富苹果叶片膜质过氧化及活性氧的含量 16 3。1。4PEG处理下寒富苹果叶片抗氧化物酶活性的变化 18 3。2寒富苹果叶片对自然干旱胁迫的生理响应 19 3。2。1自然干旱及复水处理下寒富苹果叶片叶绿素测定 19 3。2。2自然干旱及复水处理下寒富苹果叶片膜质过氧化及活性氧的含量 20 3。2。3自然干旱及复水处理下寒富苹果叶片抗氧化物酶活性的变化 22 3。2。4自然干旱及复水处理下寒富苹果叶片可溶性蛋白含量及脯氨酸含量 23 3。2。5自然干旱及复水处理下寒富苹果叶片ABA的含量 25 3。3寒富苹果叶片转录组分析 25 3。3。1PEG模拟干旱下寒富苹果叶片的转录组分析 25 3。3。2重度自然干旱下寒富苹果叶片的转录组分析 38 第四章讨论 45 4。1寒富苹果叶片对水分胁迫的生理响应 45 4。2寒富苹果叶片对水分胁迫的分子响应 46 第五章结论 49 参考文献 51 致谢 63 Contents 摘要 1 ABSTRACT 3 第一章前言 4 1。1聚乙二醇模拟干旱胁迫对植物的影响 4 1。2干旱对植物的影响 5 1。3植物对干旱胁迫的生理响应机制 5 1。3。1干旱对植物光合作用的影响 5 1。3。2干旱对植物活性氧及抗氧化酶的影响 6 1。3。3干旱对植物渗透调节物质的影响 6 1。4干旱胁迫后复水对植物生理生化指标的影响 7 1。5干旱胁迫下植物转录组测序的研究进展 7 1。6本研究的目的与意义 9 第二章材料与方法 11 2。1试验材料 11 2。2试验处理 11 2。2。1PEG模拟干旱胁迫处理 11 2。2。2自然干旱处理 11 2。3试验方法 11 2。4转录组分析 12 2。4。1cDNA文库构建测序和分析 12 2。4。2序列拼接和基因功能注释分析 12 2。4。3GOKEGG富集分析 12 2。4。4基因差异表达分析及共表达基因聚类分析 13 2。4。5实时荧光定量PCR 13 2。5数据分析 14 第三章结果与分析 15 3。1寒富苹果叶片对PEG处理的生理响应 15 3。1。1PEG处理下寒富苹果叶片水势测定 15 3。1。2PEG处理下寒富苹果叶片叶绿素测定 15 3。1。3PEG处理下寒富苹果叶片膜质过氧化及活性氧的含量 16 3。1。4PEG处理下寒富苹果叶片抗氧化物酶活性的变化 18 3。2寒富苹果叶片对自然干旱胁迫的生理响应 19 3。2。1自然干旱及复水处理下寒富苹果叶片叶绿素测定 19 3。2。2自然干旱及复水处理下寒富苹果叶片膜质过氧化及活性氧的含量 20 3。2。3自然干旱及复水处理下寒富苹果叶片抗氧化物酶活性的变化 22 3。2。4自然干旱及复水处理下寒富苹果叶片可溶性蛋白含量及脯氨酸含量 23 3。2。5自然干旱及复水处理下寒富苹果叶片ABA的含量 25 3。3寒富苹果叶片转录组分析 25 3。3。1PEG模拟干旱下寒富苹果叶片的转录组分析 25 3。3。2重度自然干旱下寒富苹果叶片的转录组分析 38 第四章讨论 45 4。1寒富苹果叶片对水分胁迫的生理响应 45 4。2寒富苹果叶片对水分胁迫的分子响应 46 第五章结论 49 参考文献 51 致谢 63 摘要 干旱是制约果业可持续发展的一个重要因素。干旱会造成植物体的水分缺失当植物体内的水分减少时相应的会导致植物体内的活性氧增加进而会导致植物体产生氧化胁迫损伤影响植物体正常的生长A是一种植物在应对干旱胁迫的一种重要的激素。经前人研究报道，植物叶片细胞中ABA通过调节某些渗透调节物质进而调节叶片细胞的渗透势。当植物受到干旱胁迫时，添加外源ABA能提高植物体内抗氧化酶活性减少活性氧的积累并且植物体内的渗透调节等物质的含量受本试验通过对寒富苹果进行PEG预处理干旱及复水处理，研究寒富苹果叶片的生理及分子响应，主要研究结果如下， 通过研究PEG预处理对水分胁迫下寒富苹果叶片的生理响应，发现PEG处理浓度越高，寒富苹果叶片的水势叶绿素含量越降低，丙二醛活性氧含量以及抗氧化酶活性越高，对寒富苹果叶片正常生理代谢的破坏作用越明显，而在相同PEG浓度处理下的寒富苹果叶片，随着时间的延长，其水势叶绿素含量呈下降趋势，丙二醛活性氧含量呈上升趋势，抗氧化酶活性呈先上升后下降的趋势，表明干旱程度越重，寒富苹果受到的伤害越重，寒富苹果在一定时间内对干旱起抵御作用，但随着时间的增加，寒富苹果的生长发育仍受到不利影响。 通过研究干旱胁迫及复水下寒富苹果叶片的生理响应，发现丙二醛，MDA，活性氧，ROS，可溶性蛋白含量脯氨酸，Pro，含量过氧化物酶，POD，过氧化氢酶，CAT，活性和ABA含量均随着干旱胁迫加重而显著增加，复水后迅速减少。叶绿素含量随着干旱胁迫的延长呈先上升后下降的趋势，在复水期间叶绿素含量迅速增加，但一直低于对照。这说明干旱程度的加深，严重影响寒富苹果的正常生长及代谢，复水虽然能对寒富苹果起补偿效应，但不能完全恢复到其正常状态。 通过对PEG模拟干旱下寒富苹果叶片的转录组分析，共获得487903916条高质量序列，cleanreads，，共获得了3806个差异基因，有1419个基因在不同干旱时间内上调表达，有2387个基因在不同干旱时间下调表达。这些基因在干旱胁迫下主要富集于代谢过程和激素信号转导，筛选的5个基因，ABA受体PP2C77，evm。TU。scaf_69。7，PP2C24，evm。TU。scaf_98。279，MYB14，evm。TU。scaf_97。67，MYB36，evm。经实时荧光定量PCR，qRTPCR，其表达量与RNASeq检测结果一致。 通过对重度干旱下寒富苹果叶片的转录组分析，共获得257318032条高质量序列，cleanreads，，2238个差异基因，其中有1199个基因在重度干旱条件下上调表达，有1039个基因在重度干旱条件下下调表达。这些基因在干旱胁迫下主要富集于代谢过程及光合方面。 综合两次转录组的数据信息可以看出，在重度干旱胁迫下，寒富苹果叶片中有大量基因表达，主要在以下几个方面，1，光合作用方面，部分关于光合结构细胞成分，类囊体类囊体膜，及叶绿素和血红素合成过程中起重要作用的四吡咯结合等)的基因显著表达，2，氧化还原酶方面，大量氧化还原酶基因得到表达，很多重要的抗氧化酶活性显著下降，比如APXPOD，3，代谢方面，在生物过程中的调控代谢过程的基因得到表达，例如碳水化合物代谢过程葡聚糖代谢过程4，转录因子方面，Pkinase转录因子家族Myb转录因子家族PP2C转录因子家族WRKY转录因子家族bZIP转录因子家族等均有大量差异基因显著表达。 关键词，干旱，寒富苹果，转录组测序，RTPCR ABSTRACT environmentalfactorrestrictingthesustainabledevelopmentofthefruitindustry。Plantsaccumulatealargeamountofreactiveoxygenspecies(ROS)intheirbodiesunderdroughtstressleadingtodamagefromoxidativestressthataffectstheiormalgrowthandwhichmayevenresultindeathinseverecases。Thereforestudiesondroughtresistancemechanismsinappleareessentialtoenhancethisrespoe。ABAisaplanthormonethatplaysanimportantroleindealingwithdroughtstress。PreviousstudieshavereportedthatABAregulatestheosmoticpotentialofplantleafcellsbyregulatingcertainosmoticsubstances。ThuswhenplantsareunderdroughtstresstheadditionofexogenousABAcanimprovetheactivityofantioxidantenzymesinplantstherebyreducingtheaccumulationofROSandinfluencingthecontentofosmoticregulatorysubstanceseffectivelyalleviatingthedamagecausedbydroughtstress。InthisexperimentphysiologicalandmolecularrespoesinHanfuappleleaveswerestudiedafterpolyethyleneglycol(PEG)pretreatmentdroughtandrehydrationtreatment。Themainresultsareasfollows: TheanalysisofphysiologicalrespoestoPEGpretreatmentinHanfuappleleavesunderwaterstressrevealedthatwaterpotentialandchlorophyllcontentcorrelatesnegativelywithincreasingPEGconcentrationwhilerisingmalondialdehydeROSandantioxidantenzymeactivityresultsinanincreasinglyobviousdamagetonormalphysiologicalmetabolism。FurthermorewaterpotentialandchlorophyllcontentinleaveswithinasinglePEGconcentrationtreatmentgroupshowedadecreasingtrendbytimewhereasmalondialdehydeandROSconcentrationrosegraduallywhileantioxidantenzymeactivityfellcoistentlyafterasteadyriseindicatingthattheheavierthedegreeofdroughttheheavierthedamagecausedtoHanfuappleplants。TheHanfuapplevarietyresistsdroughtforacertainperiodoftimebutthenitsgrowthanddevelopmentbecomesadveelyaffected。 ThephysiologicalrespoeofHanfuappleleavesunderdroughtstressandrehydrationtreatmentwasstudiedItwasfoundthatmalondialdehydeandROSconcentrationaswellasthesolubleproteinprolineandperoxidasecontentcatalaseactivityandABAcontentallincreasedsignificantlywiththeaggravationofdroughtstressanddecreasedrapidlyafterrehydration。Whendroughtstresswasextendedchlorophyllcontentincreasedinitiallybeforesubsequentlyreducing。Itroserapidlyduringtherehydrationperiodthoughitsvaluewasalwayslowerthanthatofthecontrolgroup。CoequentlyanincreasingseverityofdroughtseriouslyaffectsnormalHanfuapplegrowthandmetabolism。 AtracriptomeanalysisofPEGsimulatedHanfuappleleavesunderdroughtprovidedatotalof487903916cleanreadstogetherwithatotalof3806differentiallyexpressedgenesincluding1419upregulatedgenesand2387downregulatedgenesatdifferenttimesduringdrought。Thesegenesweremainlyenrichedinmetabolicprocessesandhormonesignaltraductionunderdroughtstress。AbscisicacidreceptoPYL4(evm。tu。scaf_37。191)phosphoproteasePP2C77(evm。tu。scaf_69。7)andPP2C24(evm。tu。scaf_98。279)tracriptionfactoMYB14(evm。tu。scaf_97。67)andMYB36(evm。tu。scaf_83。3124)wereexpressedinthesameamountsshownbyRNASeqandbyrealtimequantitativePCR(qRTPCR)。 AtracriptomeanalysisofHanfuappleleavesunderseveredroughtyieldedatotalof257318032cleanreadsand2238differentialgenesamongwhich1199geneswereupregulatedand1039genesweredownregulated。Thesegenesweremainlyassociatedwithmetabolicprocessesandphotosynthesisunderdroughtstress。 BasedonintegratedtracriptomedatathehighlevelofgeneexpressionobservedinHanfuappleleavesunderseveredroughtstresswasassociatedmainlywiththefollowingaspects。1)photosynthesisaspects:certainphotosyntheticstructurecomponents(thylakoidthylakoidmembraneandthoseplayinganimportantroleintheprocessofchlorophyllandthesynthesisoffourpyrroleringswithhemeetc。)asproductsofgeneexpressionaresignificant2)oxidoreductase:alargenumberofoxidoreductasegenesareexpressedandtheactivityofmanyimportantantioxidantenzymessuchasascorbateperoxidase(APX)andperoxidase(POD)decreasesignificantly3)metabolism:genesregulatingmetabolicprocessesinbiologicalprocessessuchascarbohydratemetabolismglucanmetabolismcellulosebiosynthesisandothermetabolicprocessesareexpressed4)tracriptionfactoofPkinasetracriptionfactorfamilyMybtran...
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