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• 内容摘要：毕业论文（2021届）题目纤维素降解菌的筛选及特性研究学院生态环境学院专业环境科学年级2017级学生学号2021年4月30日纤维素降解菌的筛选及特性研究摘要生物堆肥是大部分养殖场固废资源化利用的主要手段，具有投资小、效益高、有机固体废弃物重复资源化利用效率高等优点，但堆肥过程中也存在一些缺陷，如发酵周期长、有臭味、纤维素木质素分解不彻底等。牛粪中含有大量未能消化的纤维素和半纤维素，它们是影响堆肥腐熟进程、决定其堆肥产品质量的关键因素。因此，在牛粪堆肥发酵中选择添加合适的堆肥发酵菌剂和高效纤维素降解菌剂，是解决畜禽粪便堆肥周期长，降解率低等问题的有效途径。本研究采用富集培养及纯培养法从牛粪中将纤维素降解细菌进行分离并分析其降解特性，以期获得一些高效纤维素降解菌。采用水解圈法和3，5二硝基水杨酸（D）法进行菌株筛选与酶学特性研究，结合形态学方法对其初步鉴定，分子生物学方法对其鉴定其种属，共得到降解效果良好的菌株3株，分别命名为DH01、DH02、DC02，其中DH01为枯草芽孢杆菌，其纤维素酶活性最高；DH02为苏云金芽孢杆菌，纤维素酶活性次之；DC02为贝莱斯芽孢杆菌，纤维素酶活性低于前两者。三种菌株均能不同程度分解纤维素，因此，可为牛粪堆肥发酵提供菌种思路，具有重要应用价值。关键词：纤维素降解菌，纤维素酶，分离，酶学特性AbstractBiologicalcompostingisthemainmethodfortheutilizationofsolidwasteresourcesinmostfarms。Ithastheadvantagesoflowinvestmenthighefficiencyandhighefficiencyinthereuseoforganicsolidwaste。HowevertherearealsosomeshortcomingsinthecompostingprocesssuchaslongfermentationcyclesandOdorincompletedecompositionofcelluloseandligninetc。Cowmanurecontaialargeamountofundigestedcelluloseandhemicellulosewhicharethekeyfactothataffectthematurityofcompostanddeterminethequalityofthecompostproduct。Thereforeselectingandaddingappropriatecompostingfermentationinoculantsandhighefficiencycellulosedegradinginoculantsinthecattlemanurecompostingfermentationisaneffectivewaytosolvetheproblemsoflongcompostingcycleoflivestockandpoultrymanureandlowdegradationrate。Inthisstudyenrichmentcultureandpureculturemethodswereusedtoisolatecellulosedegradingbacteriafromcowmanureandanalyzetheirdegradationcharacteristicsinordertoobtaiomehighefficiencycellulosedegradingbacteria。Usinghydrolysiscirclemethodand35dinitrosalicylicacid(D)methodfotraicreeningandenzymaticcharacteristicsresearchcombinedwithmorphologicalmethodsforpreliminaryidentificationmolecularbiologicalmethodstoidentifyitsspeciesatotalofThreestraiwithgooddegradationeffectswerenamedDH01DH02andDC02。AmongthemDH01isBacillussubtiliswiththehighestcellulaseactivityDH02isBacillusthuringieisfollowedbycellulaseactivityDC02isBacillusvelezsBacilluscellulaseactivityislowerthantheformertwo。Thethreestraicandecomposecellulosetodifferentdegreessotheycanprovidestrainideasforcattlemanurecompostingandfermentationwhichhasimportantapplicationvalue。Keywords:cellulolyticbacteria，Cellulase，isolation，enzymaticproperties目录1。引言12。材料与方法22。1试验材料22。1。1样品来源22。1。2培养基22。1。3供试溶液22。1。4供试仪器22。2试验方法32。2。1纤维素降解菌的富集32。2。2纤维素降解菌的初筛32。2。3纤维素降解菌的复筛及酶活测定32。2。4纤维素降解菌的滤纸条崩解实验42。2。5纤维素降解菌的生物学鉴定43。数据与分析43。1纤维素降解菌的富集、分离与纯化43。2纤维素降解菌的初筛53。3滤纸崩解实验53。4维素降解菌的鉴定53。4。1菌株形态学鉴定53。4。2纤维素降解菌的分子生物学鉴定63。5纤维素降解菌的酶活测定73。5。1标准曲线的制作73。5。2酶活的测定74。结论与展望84。1结论84。1。1实验结果84。1。2讨论84。2展望9参考文献10谢辞12引言纤维素是植物细胞壁的重要结构成分，容易与其结合的物质有许多，比如木质素以及果胶等，其结合方式和程度也决定着其资源化利用的能力。纤维素虽然是一种较为廉价的多糖物质，但其广泛地分布于地球上。作为有机物，它们大多都没有得到有效的利用，而是被直接丢弃或者烧毁。现状表明这种做法严重浪费了宝贵的物质资源，从长远发展的角度来看，是不可取的，应尽快提出合理高效利用纤维素的解决方案，对其进行充分利用。纤维素存在于各种有机固体废弃物中，如秸秆、谷壳、废渣和畜禽粪便等。经分析可知，作为直链的纤维素多糖链并不存在分支，但存在糖残基，在糖残基里存在不少羟基，这些羟基会呈一定规律排列，当糖残基和羟基发生反应时，就会有氢键形成，这些氢键能够令多糖链结合得更加紧密，其结构也会更稳固。分析纤维素结构可知，其内部主要可以划分为两个区域，一个是结晶区；一个是无定形区，和前者相比，后者不但疏松度高，而且并不具备较大的分子密度，所以并无结晶结构存在。虽然纤维素可以分为这两个区域，但是两者之间是渐变过渡，而非泾渭分明，其中结晶完善度和两方面存在关联，这两方面首先是纤维部位；其次是纤维素。经分析发现，在无定形区中，其多糖链更容易和各类物质比如化学试剂等接触，所以相较而言，该区域的降解难度更小。通常在植物纤维里，有百分之七十都是微晶纤维素，其余则是无定形纤维素。在这种情况下，纤维素存在较大的降解难度。目前对纤维素的处理方法主要有物理、化学处理法和生物降解法(文少白等，2010)，需要注意的是，物化处理法存在一些缺点，比如需要花费较高成本，反应条件也较为剧烈等等(陈洪章等，2005)。而生物降解法则是添加纤维素高效降解菌到畜禽粪便中进行堆肥发酵，这种方法因经济和有效，已成为当前的研究热点(侯会利等，2015Baldrianetal。，2008)。翻阅科研人员在纤维素降解方面的研究成果能够发现，当前有数千种微生物能够对纤维素进行降解，其主要包括三类，首先是细菌，这类细菌一般都为单细胞，和另外两类微生物相比，其体积是最小的，代谢期间，其存在较高的物质交换速率；其次是真菌，这是对纤维素进行降解的主力军，当前许多学者都对真菌选育问题展开了细致研究，其研究对象涉及米曲酶、黑曲酶等；最后是放线菌，此类微生物与真菌相比放线菌具有一些优势如耐各种高温、酸碱度等，因此，在高温条件下，微生物降解纤维素起着主要作用的就是放线菌。随着畜禽养殖业迅速发展，在产生巨大经济效益和社会效益的同时，也会生成许多粪便，产生环保问题，因此当前亟需合适的手段来对粪便进行妥善处理。根据2015年的中央一号文件“加强农业面源污染治理，开展畜禽粪便资源化利用”的污染治理原则，应尽可能的对畜禽粪便进行减量化、无害化、资源化的综合治理，在减轻污染程度的前提下最大程度的实现畜禽粪便的资源化利用(李季，2011)。针对当前情况，本研究从宁夏某牧业养殖场采集牛粪，分离出三株具有纤维素降解功能的芽孢杆菌，对其进行形态学观察，16SrDNA基因序列分析，并对其进行水解圈测定、滤纸条崩解试验，进一步筛选可高效降解纤维素的菌株，以期为缩短牛粪发酵腐熟周期、开发牛粪堆肥菌剂及提高堆肥效率提供优良菌株来源。材料与方法试验材料2。1。1样品来源实验样品来自宁夏某农牧业养殖场，采集后放置于4℃冰箱保存。2。1。2培养基富集培养基：胰蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母浸膏粉5g，蒸馏水1000mL，121℃，101kPa条件下灭菌30分钟。分离培养基：牛肉膏3。0g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，121℃，101kPa条件下灭菌30分钟。筛选培养基：羧甲基纤维素钠(CMCNa)20g，KH2PO41。5g，Na2HPO42。5g，蛋白胨2。5g，酵母浸膏粉0。5g，琼脂20g，pH调至7，蒸馏水1000mL，121℃，101kPa条件下灭菌30分钟。发酵培养基：用于测定酶活。麸皮50g，蛋白胨3g，氯化钠5g，（NH4）2SO43g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0。3g，用NaOH饱和溶液调至pH为7。0，101kPa灭菌30min。滤纸条崩解培养基：（NH4）2SO43g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0。4g，酵母浸膏粉0。1g，pH7。0，101kPa灭菌30min。革兰氏碘液：用于纤维素水解圈的测定。KI2。0g，I21。0g，H2O300ml。D试剂（3，5二硝基水杨酸）按照农业部标准D试剂配制，柠檬酸缓冲溶液、葡萄糖标准溶液按照QB25832003标准配置。2。1。3供试溶液葡萄糖、磷酸缓冲液、D显色剂、NaOH、微晶纤维素、CMCNa2。1。4供试仪器表21纤维素降解菌筛选及酶活测定涉及的主要仪器Table21Themainequipmentinvolvedinthescreeningofcellulosedegradingbacteriaandthedeterminationofenzymeactivity名称型号厂家洁净工作台HJCJ2D上海苏净实业有限公司续表21名称型号厂家电热鼓风干燥箱DHG9203A上海实研电炉有限公司恒温培养箱DHP9162上海一恒科学仪器有限公司电子恒温水浴锅PK824上海精宏实验仪器有限公司分析天平JBT53741991梅特勒托利多仪器（上海）有限公司pH计pH808香港希玛仪器有限公司紫外可见分光光度计752N上海仪电分析仪器有限公司试验方法2。2。1纤维素降解菌的富集称取10g牛粪样品放置于无菌三角瓶内，称取4℃保存的新鲜牛粪10。0g，将其装入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中，振荡30min将其混匀。取1mL接入富集培养基进行富集12h。2。2。2纤维素降解菌的初筛此处准备牛肉膏蛋白胨培养基，然后选用粪便混合液作为溶液，对其进行稀释操作，得到三份两百微升的菌液，其稀释度分别为107倍、106倍、105倍，将其分别涂抹到前面的培养基中，接着将培养基放入培养箱培养一天，培养箱温度需设置为二十八摄氏度，一天后，在培养基中挑取单菌落，纯化34代斜面接种后置于4°C冰箱中保存备用；将纯化后的菌株点接于CMCNa培养基，28℃倒置培养12h，加入革兰氏碘液浸染510分钟，观察有无明显水解圈，并用测量培养基中菌落的透明圈直径(D，cm)与菌落直径(d，cm)，计算Dd二者的比值，根据比值大小初步确定分离菌株纤维素酶活力的高低。2。2。3纤维素降解菌的复筛及酶活测定在液体发酵培养基中接种菌株（此处菌株需要具备较高的Dd比值），28°C、150rmin震荡培养24h，5000rmin离心10min，取上清液用于后续纤维素酶活的测定。纤维素酶活采用D法。酶活力单位(U)规定为:在特定条件下，1分钟内转化1μmoL底物，或者底物中1μmoL有关基团所需的酶量。纤维素酶活性的测定:在25mL具塞比色管中加入用磷酸缓冲溶液配制的质量浓度1%的CMCNa溶液1mL，加入待测酶液0。5mL，50℃具塞水浴30min，加入2。0mLD试剂，具塞佛水浴5min，立即冷却，蒸馏水定容至25mL，摇匀后在波长540nm处测定吸光度值，每管做5个重复取平均值，通过查葡萄糖标准曲线求出还原糖的含量。绘制葡萄糖标准曲线:第一步，进行葡萄糖标准溶液（1mgmL）的配制。在配制这类溶液时，其原料为恒重的无水葡萄糖。第二步，准备1。2毫升、1毫升、0。8毫升、0。6毫升、0。4毫升、0。2毫升、0毫升标准溶液，分别往其中添加蒸馏水，令其都变为两毫升。第三步，分别加入两毫升D试剂，进行半小时沸水浴后，待其冷却。第四步，对其进行定容操作，令其变为二十五毫升，摇匀后，在其540nm波长处进行吸光度值的测定，各管3个重复求其均值，构建坐标轴，横纵坐标分别为葡萄糖含量、吸光度，绘制标准曲线并建立回归方程。2。2。4纤维素降解菌的滤纸条崩解实验从液体发酵培养基中的培养液取出5mL，加入盛有100mL滤纸条崩解培养基的三角瓶中，每个三角瓶放入14直径9cm的扇形滤纸，在28℃、150rmin条件下摇瓶培养，以未加菌株的摇瓶作为对照，观察滤纸条崩解情况。2。2。5纤维素降解菌的生物学鉴定将菌株接种于斜面送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，利用微生物16SrDNA通用引物27F、1492R对菌株进行扩增。将测定的序列通过NCBI进行BLAST比对，选择同源性较高的菌株序列构建系统发育树，初步确定筛选菌株的种属。数据与分析纤维素降解菌的富集、分离与纯化第一步，准备液体培养基，其中的碳源只有一个，那就是纤维素。第二步，准备牛粪液，将其中的残渣去掉，往培养基中滴入一毫升牛粪液。第三步，将其放置在120rmin摇床中培养，其温度为三十摄氏度。培养一天后，观察培养基液体，会发现，其不但出现了气泡、白膜和沉淀物（渣状），还散发出臭味，液体也十分浑浊。究其缘由，则是因为牛粪液中存在微生物，其正在降解纤维素粉，并对能够对此物质进行降解的菌株进行富集。第四步，准备纤维素固体培养基平板，然后选用三类菌液（107倍、106倍、105倍稀释度），将其分别涂抹到平板中。第五步，选择其中的单菌落，对其进行纯化操作。图31显示了获得的目标菌株的具体情况。(图31)图31分离出的6株活力较强的纤维素降解菌Figure31Sixisolatedstraiofcellulosedegradingbacteriawithstrongvigor纤维素降解菌的初筛从新鲜牛粪中分离出4株具有纤维素分解能力的菌株，通过富集及在CMCNa培养基上经革兰氏碘液染色筛选透明圈直径比值(Dd)较大的菌株分别命名为DH01、DH02、DC01、DC02、LH01、LH02。根据培养基上产生的降解圈直径(D)与菌落直径(d)比值的大小(见表2)筛选出能够降解纤维素效果较好的菌株。表31纤维素降解菌初筛结果Table31Resultsofpreliminaryscreeningofcellulosedegradingbacteria菌株编号菌落直径dcm透明圈直径DcmDdDH010。311。845。94DH020。321。765。50DC010。421。774。21DC020。411。924。68LH010。551。813。29LH020。601。893。15由表31能够发现，选择恒温培养箱，对上述菌株进行培养，然后其就能够在接触纤维素时发挥不错的降解作用，对其进行染色操作后，还会有降解圈形成。此处Dd比值于菌株纤维素酶活性成正比关系，如此就能够完成优势菌的初筛工作。但这并不能十分严格地确定菌株的产酶能力，因此还需要进一步进行深入筛选试验。滤纸崩解实验经分析可知，综合酶活力水平能够反映菌株接触纤维素时的降解能力情况，因此此处可以通过滤纸条崩解实验达到复筛目的。按照实验结果能够发现，在对各菌株培养三天后，将其分别放到带有纤维素的滤纸条上，DH01、DH02、DC02分别将其降解为不定形状、近似糊状、糊状，而其他三类菌株并未获得良好的降解效果，只是令滤纸条边缘发生了一定变化。将其和对照组的情况进行比较能够发现，上述六菌株都可以令滤纸崩解，只不过程度不同而已，此处需要保存菌株DC02、DH02和DH01用作接下来的实验。维素降解菌的鉴定菌株形态学鉴定将3株菌株于CMCNa平板上三区划线，待长出单菌落后，观察菌落形态。经观察发现菌株DH02在平板上呈圆形，边缘不规则，菌落呈淡黄色，革兰氏染色结果为阳性；菌株DHO1在平板上呈圆形，表面粗糙，菌落呈微黄色，革兰氏染色结果为阳性；菌株DCO2在平板上呈圆形，菌落呈白色，革兰氏染色结果为阳性。图32菌株DH02、DH01、DC02的革兰氏染色Figure32GramstainingofstraiDH02，DH01，andDC02纤维素降解菌的分子生物学鉴定提交到GenBank数据库的16SrDNA序列，得到DH02、DH01、DC02的序列登录号分别为MZ144117、MZ144116、MZ145243，菌株DH02、DH01、DC02的系统发育树为图3，根据比对得出DH02为苏云金芽孢杆菌、DH01为枯草芽孢杆菌、DC02为贝莱斯芽孢杆菌。图33菌株DH02的系统发育树Figure33PhylogenetictreeofstrainDH02图34菌株DH01的系统发育树Figure34PhylogenetictreeofstrainDH01图35菌株DC02的系统发育树Figure35PhylogenetictreeofstrainDC02纤维素降解菌的酶活测定标准曲线的制作根据2。2。3的方法制作葡萄糖的标准曲线，绘制标准曲线见图36其线性方程为y=0。7607X+0。0079，R2=0。9993，测定处理后各菌株的待测样品吸光值，根据线性方程计算还原糖的量。图36葡萄糖标准曲线Figure36Glucosestandardcurve酶活的测定利用D法测得三株菌的酶活力如下：图37三株菌的纤维素酶活变化Figure37Changesincellulaseactivityofthreestrai在整个培养过程中，菌株DH02、菌株DH01和菌株DC02的纤维素酶活变化趋势呈现先上升后下降的趋势。3个菌株的纤维素酶活在第四天均达到最大，分别为32。46UmL、34。24UmL和29。98UmL。其中菌株DH01纤维素酶活相对较高，而菌株DC02的纤维素酶活相对于菌株DH01和菌株DH02较低。结论与展望结论实验结果本实验样品来自于牛粪，基于富集能够降解纤维素粉的菌株，经平板划线及培养后初步筛选出6株能解纤维素的细菌，又通过水解圈的大小测定及滤纸条崩解实验后，可以筛出解纤维素能力较好的菌株，经菌株的形态学和分子生物学鉴定，本实验共分离并完成鉴定和保藏菌株3株，包括苏云金芽孢杆菌1株（DH02），枯草芽孢杆菌（DH01）1株，贝莱斯芽孢杆菌（DC02）1株。在相同的实验条件下，枯草芽孢杆菌DH01的纤维素酶活性最高，苏云金芽孢杆菌DH02的纤维素酶活性次之，贝莱斯芽孢杆菌DC02的纤维素酶活性在三者中最低。讨论在自然界中存在各种各样的碳水化合物，其中含量最高的非纤维素莫属，然而当前对于纤维素的开发率较低，这不但降低了资源利用率，还容易产生环保问题。通过分析发现，在各种纤维素降解手段中，微生物产酶这一手段存在许多优点，比如并不会造成什么污染，而且反应条件也不剧烈等。经分析可知，如今不论是在工业生产里，还是在自然界中，在对纤维素进行降解时，生物降解法是使用频率最高的手段。由前文可知，自然界中主要有细菌等三类微生物可以对纤维素进行降解，此处主要对其中的两类为微生物的优点进行分析：（1）真菌。其不但具备较高的酶活力，而且还具备较大酶量，在酶制剂生产中获得了充分运用。（2）细菌。其不但发酵快，而且培养并不复杂。由此可见，在环境中进行高产纤维素酶的细菌的分离极具必要性。在筛选产纤维素酶菌株时，筛选方式有许多。相关研究发现，像在土壤、动物粪便中，都能够找到这类菌株。比如学者Ahmad等选择牛瘤胃为实验对象，从中完成了芽孢杆菌的分离工作，这类菌株拥有较高的酶活力，能够降解纤维素。学者Sun等选择鹅盲肠为实验对象，从中完成了液化淀粉芽孢杆菌的分离工作，其也具备不错的酶活性。学者Muhamad等选择白蚁肠道为实验对象，从中完成了地衣芽孢杆菌的。。。
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