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• 本文标题：珙桐AP2ERF家族苞片发育相关基因的克隆鉴定及功能研究.docx
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• 内容摘要：摘要珙桐（DavidiainvolucrataBaill。）为落叶乔木，野生种只生长在中国西南部和中部地区，是国家一级保护濒危植物。珙桐花序的基部有对生苞片，为特殊的变态叶，苞片可能是在长期进化过程中抵抗环境变化或保护繁育器官所形成的特殊器官。因其独特的花序和特殊的遗传地位而具有极高的研究价值和观赏价值。AP2ERF转录因子广泛存在于植物中，是一个庞大的转录因子家族，已有研究证实AP2ERF转录因子与植物开花调控及花器官发育密切相关。本研究的主要目的是通过获取珙桐不同发育时期苞片和叶片转录组数据后，从中筛选出调控珙桐苞片发育相关AP2ERF家族基因，经过基因克隆、表达模式分析及功能鉴定初步探明这些基因在珙桐苞片发育过程中的调控机制，为后续珙桐开花的调控途径研究提供线索。本研究主要结果总结如下：1。根据转录组测序结果，分析获得珙桐AP2ERF家族转录因子403个。通过结构域分析、表达模式分析及差异聚类分析，最终将这些转录因子分为五个亚家族，通过生物信息学分析筛选出了可能与珙桐苞片发育相关的四个基因。2。将筛选出来的分别来自三个不同亚家族的四个目的基因DiAP21、DiDREB1、DiRAV1和DiRAV2进行克隆、序列分析及亚细胞定位，发现DiAP21主要定位在细胞质，DiDREB1、DiRAV1和DiRAV2都主要定位在细胞核中。3。进行珙桐AP2ERF基因表达模式分析。珙桐DiAP21、DiDREB1、DiRAV1和DiRAV2四个基因在叶片和苞片不同时期表达模式差异大，其中DiRAV2在苞片三个发育时期表达量都远高于叶片；在不同组织表达模式分析中发现，四个目的基因主要在花器官中有表达，根和茎几乎不表达，结合植物花发育ABCDE模型分析，该类基因可能属于A类基因，因为A类基因主要参与花萼花瓣等花器官发育而不参与雄蕊发育，表明该类基因在珙桐苞片发育中有重要作用。4。在表型分析中发现除了DiAP21转基因拟南芥植株外，DiDERB1和DiRAV2两个转基因植株相比野生型拟南芥都表现为早花现象，花器官和株高等没有明显区别，早花现象可能是因为异源AP2ERF遗传转化引起了拟南芥中其他促花因子表达上调引起的。而DiAP21转基因植株中AtSPL促花因子表达明显上调，表明AtSPL上调可能解除原本异源表达DiAP21的晚花现象。5。抗胁迫分析结果表明DiAP21、DiDREB1、DiRAV2的转基因拟南芥都有一定的抗渗透胁迫和抗盐胁迫能力，对于植物在极端环境耐逆机制的探究以及利用基因工程进行作物育种提供了线索。关键词：珙桐，苞片，AP2ERF家族，遗传转化，非生物胁迫AbstractDavidiainvolucrataisadeciduoustreewithwildspeciesonlygrowingiouthwestandcentralChina。ThebaseoftheDavidiainvolucratainflorescencehasoppositebractsandspecialmetamorphosisleaves。Bractsmaybespecialorgaformedduringlongevolutionaryprocesstoresistenvironmentalchangesorprotectbreedingorga。Becauseofitsuniqueinflorescenceandspecialgeneticstatusithashighresearchvalueandoamentalvalue。AP2ERFtracriptionfactoarewidelypresentinplants。StudieshaveconfirmedthatAP2ERFtracriptionfactoarecloselyrelatedtofloweringregulationandfloralorgandevelopmentinplants。ThemainpurposeofthisstudywastoobtaintracriptomedataofbractsandleavesatdifferentdevelopmentalstagesofDavidiainvolucrataandscreenouttheAP2ERFfamilygenesthatregulatethedevelopmentofthebractsofDavidiainvolucrata。ThroughgenecloningexpressionpatteanalysisandfunctionalidentificationtheregulatorymechanismofthesegenesinthedevelopmentofthebractsofDavidiainvolucratawaspreliminarilyexplored。ItprovidescluesfortheregulationoffloweringofDavidiainvolucrata。Themainresultsofthisstudyaresummarizedasfollows:1。Accordingtothetracriptomesequencingresults403tracriptionfactointheDavidiainvolucrataAP2ERFfamilywereidentified。Throughdomainanalysisexpressionpatteanalysisanddifferentialclusteranalysisthesetracriptionfactoweredividedintofivesubfamiliesandfourgenesrelatedtothedevelopmentofbractwereidentifiedbybioinformaticsanalysis。2。CloningsequenceanalysisandsubcellularlocalizationoffourtargetgenesDiAP21DiDREB1DiRAV1andDiRAV2fromthreedifferentsubfamiliesshowedthatDiAP21wasmainlylocatedinthecytoplasm。DiDREB1DiRAV1andDiRAV2aremainlylocatedinthenucleus。3。TheexpressionpatteofAP2ERFgeneinDavidiainvolucratawasanalyzed。TheexpressionpatterofDiAP21DiDREB1DiRAV1andDiRAV2genesweresignificantlydifferentinleafandbractstagesandtheexpressionlevelsofDiRAV2weremuchhigherinbractstagesthaninleaf。FoundindifferenttissueexpressionpatteanalysisfourmaingeneexpressioninfloralorganrootandstemhardlyexpresscombinedwiththeplantfloweABCDEmodelanalysisthegenemaybelongtoAclassbecausethemainclassAgenesepalpetalofflowerorgandevelopmentandnotparticipateinthestamendevelopmentshowsthatgenesplayanimportantroleinthedevelopmentofthedovetreebracts。4。PhenotypicanalysisshowedthatexceptforDiAP21tragenicArabidopsisplantsDiDREB1andDiRAV2tragenicplantsshowedearlyfloweringcomparedwithwildtypeArabidopsisandtherewasnosignificantdifferenceinfloralorgaandplantheight。ThephenomenonofearlyfloweringmaybecausedbytheupregulationofotherflowerpromotingfactoinArabidopsisthalianainducedbytheheterologousAP2ERFgenetictraformation。TheexpressionofAtSPLinDiAP21tragenicplantswassignificantlyupregulated。TheseresultssuggestedthatAtSPLupregulationmightrelievethelateflowering。5。TheresultsofstressresistanceanalysisshowedthatthetragenicArabidopsisthalianaDiAP21DiDREB1andDiRAV2allhadcertainresistancetoosmoticstressandsaltstresswhichprovidedcluesfortheexplorationofplantresistancemechanisminextremeenvironmentandtheuseofgeneticengineeringforcropbreeding。Keywords:DavidiainvolucrataBractAP2ERFfamilygenetictraformationabioticstress目录摘要1Abstract2目录4图表目录6第1章绪论11。1选题背景11。2文献综述21。2。1珙桐及其生物学特征21。2。2AP2ERF转录因子家族及其研究现状21。2。3植物开花调控41。3研究目的及技术路线81。3。1研究目的81。3。2研究技术路线9第2章珙桐AP2ERF家族生物信息学分析102。1材料与方法102。1。1试验材料102。1。2试验方法102。2结果与分析112。2。1珙桐AP2ERF家族转录因子汇总及分类112。2。2珙桐AP2ERF家族转录因子表达模式分析及筛选122。2。3珙桐AP2ERF家族目的基因理化性质分析152。3讨论与小结15第3章珙桐AP2ERF克隆、序列分析及亚细胞定位173。1材料与方法173。1。1试验材料173。1。2试验方法223。2结果与分析303。2。1珙桐总RNA提取及cDNA获得303。2。2珙桐目的基因编码区全长克隆313。2。3珙桐目的基因pBI221DiAP2ERFEGFP重组载体构建323。2。4珙桐目的基因编码蛋白亚细胞定位分析323。3讨论与小结33第4章珙桐AP2ERF基因功能探究354。1材料与方法354。1。1试验材料354。1。2试验方法374。2结果与分析434。2。1珙桐和拟南芥RNA提取及cDNA的获得434。2。2珙桐和拟南芥qRTPCR相关引物合成及特异性鉴定444。2。3珙桐叶片和苞片不同时期表达模式及各组织表达模式分析454。2。4pBI121DiAP2ERF融合过表达载体构建及拟南芥遗传转化464。2。5纯合转基因植株的筛选与鉴定474。2。6转基因植株表型观察484。2。7转基因植株中开花调控关键基因表达分析494。2。8转基因植株抗胁迫分析504。3讨论与小结52第5章结论、创新点及展望545。1结论545。2创新点555。3展望55参考文献56附件161攻读学位期间研究成果62致谢63图表目录图图1。1珙桐的苞片发育过程3图1。2花的五轮结构和花发育转录因子四聚体模型6图1。3植物花发育调控途径和相关基因10图1。4技术路线12图2。1珙桐AP2ERF家族成员统计15图2。2珙桐苞片和叶片发育过程中Mfuzz基因簇分类结果图17图2。3珙桐叶片和苞片发育三个时期MADSbox相关差异基因表达热图18图2。4珙桐苞片发育三个时期MADSbox相关差异基因表达热图19图3。1珙桐叶片苞片不同发育时期22图3。2pEASY®T1克隆载体结构示意图23图3。3pBI121EGFP质粒图谱23图3。4pBI221EGFP质粒图谱24图3。5珙桐总RNA提取结果电泳图36图3。6珙桐AP2ERF相关基因克隆结果电泳图36图3。7珙桐目的基因克隆序列比对图37图3。8珙桐目标基因亚细胞定位结果39图4。1珙桐各组织RNA提取结果50图4。2转基因拟南芥和野生型拟南芥RNA提取结果51图4。3荧光定量相关引物特异性鉴定52图4。4珙桐目的基因在叶片和苞片中不同时期的表达情况53图4。5珙桐目的基因在不同组织的表达情况54图4。6菌液PCR鉴定55图4。7抗性培养基筛选转珙桐DiAP2ERFs基因T1代拟南芥植株55图4。8转基因拟南芥表型56图4。9突变体、野生型及过表达拟南芥表型57图4。10各拟南芥株系莲座叶数目58图4。11转基因拟南芥中关键调控开花基因的表达情况59图4。12经胁迫处理野生型拟南芥与转基因拟南芥对比60图4。13经胁迫处理野生型拟南芥幼苗与转基因拟南芥幼苗MDA含量对比61表表2。1珙桐采样样本及编号表12表2。2AP2ERF亚家族的分类及对比14表2。3珙桐AP2ERF基因家族成员的基本信息17表3。1LB固体培养基配方22表3。2亚细胞定位实验母液配制22表3。3原生质体酶解液配制23表3。440%的PEG溶液配制23表3。5WI溶液配制23表3。6W5溶液配制24表3。7MMG溶液配制24表3。8RNA反转录体系25表3。9PCR扩增反应体系26表3。10PCR反应程序26表3。11PCR扩增目的基因引物26表3。12菌液PCR扩增反应体系28表3。13菌液PCR反应程序28表3。14增目的基因引物29表3。15双酶切反应29表3。16连接反应体系30表3。17珙桐目标基因亚细胞定位预测结果34表4。1MS和12MS固体培养基配方38表4。2拟南芥花絮侵染渗透液配方38表4。3珙桐荧光定量所用引物39表4。4拟南芥荧光定量所用引物40表4。5PCR反应体系40表4。6qRTPCR反应程序41表4。7qRTPCR反应体系41表4。8PCR反应体系44绪论选题背景珙桐（DavidiainvolucrataBaill。）为落叶乔木，由于花型似白鸽，有“中国的鸽子树”、“鸽子花树”、“水梨子”等美称，也是著名观赏植物份[13]，野生种主要分布在四川省和湖北省地区，是我国一级保护濒危植物，同时也是第三纪冰川孑遗树种，有着古老的历史[4]，和特殊的遗传地位，通常在遗传学分析文章中出现，具有极高的研究价值和园林观赏价值[5]。珙桐还被称为“活化石”，所以对珙桐生物学研究将对生物界植物的进化和保护提供更多的证据。珙桐在花期时花序下的白色大苞片十分显目，具有独特的形态，无花瓣且无托叶，基部具一对花瓣状苞片[6]。苞片在珙桐的生长发育过程中，其颜色由最初的绿色会逐渐变为淡绿色，最后变为乳白色。苞片在植物界生殖发育中作为一种特殊的器官，其功能性状在不同地区存在显著差异，这种差异可能是其在长期进化过程中抵抗环境干扰、保护繁育器官和提高授粉几率而形成的[7]。并且在珙桐苞片中，光合作用相关基因的表达几乎缺失或表达水平显著降低，而和化学防御相关基因表达水平则显著升高，暗示着苞片在保护其他花器官和吸引传粉者方面的重要作用[8]。所以将珙桐苞片作为研究对象来探索特异性花器官的发育机制，具有重要的意义和价值。植物AP2ERF是一个具有众多成员的庞大转录因子基因家族，占植物转录因子的6％～7％。几乎所有的植物中且参与多种生物学过程，例如影响植物的花、果实、种子等的发育；对植物损伤、病菌防御、干旱、高盐高温等生物胁迫和非生物胁迫做出响应，其中与开花相关的AP2基因从拟南芥中分离，这种作物的形成和花同源异型基因表达的调控中发挥着核心作用，此研究中还发现AP2在花的四种器官萼片、花瓣、雄蕊和心皮中都有RNA水平的表达[10]。随后的研究从拟南芥中克隆并鉴定了两个新的DNA结合蛋白RAV1和RAV2，RAV1和RAV2的N端与AP2ERF转录因子家族中的AP2结构域同源[11]，最近的研究结果表明，属于拟南芥RAV亚家族成员的TEM1和TEM2受多个开花通路的基因调控[12]。AP2ERF家族参与调节植物生长发育外，在响应外界胁迫中也发挥重要作用。AP2ERF转录因子作为重要的抗性调控基因在基因工程育种中日益受到重视[13][14]。而且随着生物信息学和测序技术等的发展，通过基因组测序或转录组测序等方式越来越多植物转录因子功能得到深入研究，围绕不同物种花器官特别是在不同的用途径的研究中，很多重要的基因家族成员及其功能被揭示，所以我们也通过珙桐叶片以及苞片的转录组数据，应用生物信息学从数据中去分析珙桐AP2ERF家族中与苞片发育相关的功能基因并验证。虽然AP2ERF转录因子在分子育种方面具有很重要的功能，在很多植物中的生物及非生物胁迫中也有许多研究，但是在珙桐中，目前的研究都还只停留在基因功能的初步验证程度。本研究主要探讨AP2ERF这一类转录因子参与珙桐苞片发育的相关调控机制。通过珙桐在不同时期不同部位此类转录因子的差异表达分析，筛选出珙桐苞片发育的特异性表达调控基因，通过基因克隆、基因表达模式以及转基因植株表型等分析，初步阐明此类转录因子在珙桐花发育过程中的作用，为后续珙桐开花调控机制研究奠定基础。文献综述珙桐及其生物学特征珙桐（DavidiainvolucrataBaill。）是经历第三纪冰期浩劫后存活下来的孑遗植物[15]是我国特有的古热带植物区系遗迹种，由于适应性差和严重的盗伐，这种稀有植物正在消失[16]。有植物大熊猫的美誉，它也是我国特有的珍稀植物。生存范围较小，大部分分布在我国的四川、云南等西南地区，地理范围为27°~33°N、98°~111°E[17]。珙桐在每当开花时远远望去就像一群白鸽在枝头展翅高飞被植物学家们称之为“中国鸽子树”或“手帕树”[18]。珙桐为落叶乔木，可生长到15～25米高，最高可达30米以上。首先，我们所研究的就是李楠解的书皮的颜色，在我们的观察中，我们发现拟南芥的树皮普遍呈灰黄色或者是深褐色，而且很多其他的枝条当中具有不同的形状，在长度上也有所不同，在形状上也具有各自的差异，并且投中的花絮有一些是成球形的，而其他的花絮形状则会产生一定的差异，所以，在进行研究时，我们通过对包片的颜色啊进行研究，并且观察其转换的不同状态而判断其中的类别所在，在我们进行观察，我们发现其中的果实是核果，并且整个形状上呈长卵圆形，黄色可能会具有一些黄色的斑点，如果比较薄的话那么就会与其它的种类当中产生一定的差异性，而且这种花在开放史普遍是在4月到5月这个范围之内，并且，开花的期间，长短也与温度息息相关，因此很多气温高的话，开的就比较早。而一些气温比较低的话，开的就比较晚，所以我们通过对花器来进行研究，可以判断，其中所代表的主要特征就是能够在花絮的基部长出对应的包片，经过考察之后，我们发现这两种形态比较相信的物质当中具有三个包品或者是四个包皮，数量与种类产生了密切的关系。图1。1珙桐的苞片发育过程Figure1。1BractdevelopmentofDavidiainvolucrata现阶段珙桐多方面的特别是多样性研究曾经就有一定的结论所表明，很多由于外部因素，也就是气候变化和人为干扰等，往往会使我们必须要加强一些植物在原产地方面的保护，要尽量拓宽种子进行繁殖时的有效期限限行，并且进行多样化的保护，再有必要时可以行相关的理论来进行探讨，研究生物学方面的相关知识，并且将生理发育过程中产生的具体现象进行有效的体现。并将有意义的成果推广到实际保护应用中。而且目前关于珙桐的研究除了在个体和和群体水平上以及遗传等方向的研究较多以外，在分子水平的研究还较少，特别是关于珙桐AP2ERF家族对苞片发育影响相关的研究。AP2ERF转录因子家族及其研究现状在我们进行研究的过程中，我们可以发现，转录因子在实际上是一种能跟基因进行结合的一种物质，并且从而能够保证整体目的的基因会在某一强度或者是时间的表达之下而形成一种独特的蛋白质分子，我们根据其中的转录因子来进行激活或者抑制的现象，并且将其进行分类，主要分为两类，也就是激活和抑制子。我们根据对这两者来进行分类，来探讨其中的抑制作用，并且在结合到对应的子曲时，可以对这些蛋白进行转换，从而能够使得很多被动的抑制子没有对应的抑制区进行转入，因此的整体反应当中，并且将其中的反应数据进行记录，激活对应的竞争效能。根据这些被动的意志子和益智区来进行转换和整体的抑制作用，在我们进行研究，你那件事，我们对其研究了一共有147个转录因子，我们发现其中有23个左右的积蓄能够进行转换，并且可以再转换的作用之下进行排序。植物AP2ERF是一个庞大的转录因子基因家族并且具有众多的家族成员，根据结构域的数量和识别序列的不同可以将其分为五个亚家族:。。。
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