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• 本文标题：小豆裂荚材料转录组.docx
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• 内容摘要：小豆裂荚材料转录组分析裂荚现象普遍存在于豆科植物中，是影响作物产量的重要农艺性状，是豆科植物减产的主要原因之一，目前有关豆科作物裂荚的研究集中于果荚的显微结构、生理学分析和基因的分子生物学三个方面。本实验采用小豆裂荚材料CWA093和小豆不裂荚材料JN6进行转录组分析，比较小豆裂荚材料和不裂荚材料间基因差异表达情况，并对重要的差异表达进行qRTPCR进行验证。从而确定小豆裂荚候选基因，初步解析小豆裂荚特性形成的机理，为探究小豆裂荚调控机制提供支持。结果如下：引言小豆（Vignaangularis(Willd)Ohwi&Ohashi），别名红小豆，赤豆等，为一年生草本植物[1]，隶属豆科(Leguminosae)，豇豆属(Vigna)[2]。起源于中国，是我国古老的栽培作物之一。我国是全球小豆生产量最高的地区，是我国重要的出口创汇作物之一[2]。小豆自身含有多种微量元素、氨基酸，其蛋白质要比其他谷类作物更高，达2至3倍的差距[45]；小豆对于人体而言，还能起到净化血液、通便利尿等方面的作用[3]。国内种植小豆已有上千年的历史[3]。所以小豆种质资源极为丰富，但研究基础薄弱。2015年，Yang等完成了小豆全基因组测序[6]，从基因组层次加快了对小豆农艺性状的研究分析。1。1豆科作物裂荚研究进展豆科植物果实为荚果，由2层荚瓣组成，并由背、腹缝线连接，种子包含在中央腔内。内在微观组织结构差异决定了外在裂荚特性的不同。豆荚开裂是影响作物产量的重要农艺性状之一豆科植物的种子包裹在荚中当种子成熟时果荚可以沿着背缝线和腹缝线开裂从而释放种子的过程[7]称之为裂荚。通过裂荚进行种子释放是许多野生物种的繁殖特性[8]，裂荚是豆科植物自然生产繁殖所需的自然属性。与易裂荚野生种相比，抗裂荚种的果荚有一些特殊的解剖学特征。如在大豆中，栽培种和野生种间一个重要的微观结构差异可能是由腹缝线处维管束细胞壁的纤维帽细胞厚度不同而产生的。从野生大豆到栽培大豆的驯化过程中，裂荚区下方的纤维帽细胞的次生壁显著加厚，增大了荚瓣分离所需的拉力，因此有效地阻止果荚开裂。大豆裂荚发生的细胞学结构特征、大豆品种间豆荚形态特征各异，同时大豆品种的裂荚表现形式也各不相同，暗示裂荚现象的发生可能与豆荚的组织结构特征密切相关。Carlson等[9]研究表明，大豆豆荚内部厚壁层细胞水分丢失后产生的扭转拉力是裂荚发生的诱因；Tsuchiya[10]和Tiwari等[11]对栽培大豆豆荚的形状、大小与裂荚率之间的关系进行了研究，发现抗裂荚品种豆荚的厚度与宽度的比值相对较大，豆荚的背部包帽的厚度、长度及荚皮厚度等3个荚部特征与裂荚呈显著负相关；Christiaen等[12]和Summe等[13]则提出，在栽培大豆豆荚的背部和腹部的缝合线处存在类似于十字花科植物开裂区(Dehiscencezone)的类似结构，该结构与大豆抗裂荚能力密切相关。Tiwari等[14]在大豆果荚解剖学研究中发现，最早引起裂荚的原因是背缝线处维管束帽2个瓣间离层细的降解，并指出不同大豆品种，维管束帽瓣的间隙越大，果荚越易开裂。然而，也有报道指出腹缝线才是裂荚的起始部位。Dong等[15]在大豆裂荚的研究中发现，果荚开裂的关键结构并不是裂荚区内离层细胞，而是腹缝线处裂荚区下方的纤维帽细胞纤维帽的厚度将直接影响果荚开裂时所需的机力，这可能是支持裂荚开始于腹缝线的有力证据。综上所述，豆科植物裂荚特性不仅与果荚某些形态特征存在相关性，从果荚微观结构分析，豆科植物裂荚特性还与果荚的裂荚区存在着明显的相关性。然而，目前关于果荚裂荚区的研究仅在大豆中相对成熟，诸如豌豆、箭罟豌豆、扁豆等重要牧草作物中还鲜有报道，小豆中更是未有提及。因此，对小豆裂荚性状的研究对小豆生产十分重要。1。2裂荚基因研究进展根据目前研究进展发现了五个与裂荚相关基因，分别是pdh1[16]、SHATTERING15(SHAT15)[17]、PODDEHISCENCE1(GmPDH1。1)[18]、GmAGL8[20]和MYB26[21]。目前在大豆中发现Pdh1基因通过增加干燥豆荚壁的扭转来促进豆荚开裂，是低湿度条件下豆荚开裂的驱动力。而抗裂荚的基因型pdh1基因有缺陷，发生了提前终止，从而降低干燥豆荚壁的扭转，达到了抗裂荚的效果[16]。NAC基因家族中的SHAT15基因是调控大豆裂荚的关键基因。通过进一步的免疫组织化学蛋白定位和基因功能互补实验，现由于SHAT15基因的上游4kb处有1个被完全移除的抑制子，使得SHAT15基因在抗裂荚大豆品种的荚果腹缝线FCC（纤维帽细胞）中的表达强烈上调，表达量为易裂荚大豆品种的15倍，从而导致抗裂荚大豆品种FCC细胞数目增多，激活次生壁合成并促进纤维帽状细胞次生壁的显著增厚，促进木质素的沉积，使栽培大豆抗裂荚[17]。GmPDH1。1基因能够编码一种介导类蛋白质，参与木质素的生物合成[19]。2014年Funatsuki等人分析得出GmPDH1。1在内壁组织中高表达，与木质素沉积相关[16]，2015年董等人又发现GmPDH1。1通过增加荚壁的扭转力导致荚开裂[18]。MADbox基因家族的FUL对拟南芥角荚果开裂起负调节作用，在拟南芥中过表达FUL基因导致其成熟角果的荚果不开裂[22]。将拟南芥的FUL基因与大豆进行比对，发现大豆中的AGL8基因与FUL基因同源性较高。李冉阳等根据拟南芥FUL基因通过同源扩增从大豆中克隆得到GmAGL8[20]。转化GmAGL8，转基因与非转基因大豆之间裂荚率存在明显差异，表型结果初步证明了GmAGL8基因与大豆裂荚性状相关[23]。在豆科植物中，2021年被Valerio等人认为同源基因PvMYB26是菜豆抗裂荚的最佳候选基因，该基因在裂荚中早期和精细上调，且荚果不开裂符合由孟德尔遗传规律由隐性遗传基因控制[21]。1。3影响炸荚的关键酶开裂区的破坏取决于多种细胞壁修饰酶和导致细胞结构变化的基因。有关豆荚开裂区细胞壁结构方面的研究，主要集中在有关胞壁间果胶的变化。果胶是一种带负电荷的复杂高分子量多糖主要存在于陆生植物的细胞壁中占植物干重的三分之一。它主要由不同甲酯化程度的半乳糖醛酸以α14糖苷键共价连接而成，由于果胶多糖的复杂性其降解需要多种果胶酶共同作用包括多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase）、果胶酸裂解酶（PectateLyase）、鼠李糖聚半乳糖醛酸酶（rhamnosepolygalacturonase）、果胶甲酯酶（pectinmethylesterases）和果胶乙酰酯酶（pectinacetylesterase）。而细胞壁修饰酶包括内切多聚半乳糖醛酸酶（endopolygalacturonase）、葡糖苷酶（Glucosidase）、果胶酯酶（pectinesterase）、几丁质酶（Chitinase）和β半乳糖苷酶（βGalactosidase）。其中最受关注的酶是内切多聚半乳糖醛酸酶（RDPG1），它已被证明可促进细胞间质果胶层的分解。已有报导表明，细胞壁修饰和水解酶基因βglucosidase和endopolygalacturonase一起分解果胶和纤维素的糖苷键，促进豆荚腹缝线细胞壁的溶解，使豆荚更容易破碎[24]。1。4研究目的与意义豆科植物的裂荚现象普遍存在，选育抗裂荚的优良品种，是人们育种的主要目标之一。通过转录组对小豆裂荚相关基因的差异表达分析，以期探究小豆果荚发育过程中涉及的关键基因和途径，对小豆裂荚的分子机制形成初步的了解。开发和利用小豆裂荚相关基因，为品种改良奠定基础。第二章复叶转录组分析RNASeq(RNAsequencing)即转录组测序，属于新一代测序方法。转录组是对特定的组织器官或者细胞在功能状态下或特定阶段所能转录出RNA的总和。RNASeq通过高通量测序平台对所有转录RNA反转建立cDNA文库并对其测序，通过统计相关Reads计算出不同的mRNA表达量，为分析转录本的表达水平提供依据。RNASeq在分析基因的表达及不同样本间基因差异表达和基因代谢途径的分析中都发挥了重要的作用。同时RNASeq能够揭示复杂的生物学过程和相关分子调控网络，是挖掘基因功能的重要方法。本章节中，通过对小豆裂荚材料CWA093和小豆不裂荚材料JN6进行转录组分析，已期对小豆裂荚的遗传调控有初步的了解。3。1。1试验材料北京农学院小豆课题组提供本实验小豆不裂荚材料JN6和裂荚材料CWA093。两份材料均在田间采集腹缝线和背缝线，各取三个重复材料。放入液氮速冻，80℃冰箱保存。3。1。2试验方法3。1。2。1RNA提取和质量检测本实验采用过柱法提取JN6和CWA093两份材料的腹缝线和背缝线样本RNA，每个部位各三个生物学重复，共提取24份RNA。提取样品totalRNA并使用DNaseI消化DNA后，使用Agilent2100Bioanalyzer检测RNA的浓度、RIN值、28S18S和片段大小，以确定RNA的完整性；通过紫外分光光度计NanoDrop检测RNA的纯度（OD260280）以下方法对RNA样品进行检测，检测结果达到要求后进行建库。3。1。2。2cDNA文库构建、测序、原始数据组装样品检测合格后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物的mRNA；加入fragmentationbuffer将mRNA打断成短片段；以mRNA为模板，用六碱基随机引物（randomhexame）合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNApolymeraseI合成第二条cDNA链，并用试剂盒纯化双链cDNA；纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头；最后进行PCR扩增，构建cDNA文库。使用IlluminaHiSeq高通量测序平台测序。本研究RNASeq文库，均由3株样本等量混匀而成，3次生物学重复。小豆不裂荚材料JN6的腹缝线和背缝线样本文库分别为JN6B和JN6F；裂荚材料CWA093的腹缝线和背缝线样本文库分别为CWA093B和CWA093F。对测序所得原始数据进行过滤，过滤后数据与日本版小豆参考基因组进行比对（https:viggs。dna。affrc。go。jpdownload_Vangularis_v1）。3。1。2。3差异表达基因的筛选和功能注释对IlluminaHiSeq测序得到的rawdata进行过滤，将过滤得到的cleanreads比对到参考序列。基于比对结果，并对已知基因和新基因进行定量分析，根据基因在不同样品组中的表达量进行差异表达分析，对筛选出的差异表达基因进行GO功能分析、KEGG富集分析和Pathway功能分析。从而确定差异基因同GO分类中某几个特定的分支的关系，获得差异表达基因在GO中的显著富集类别。通过对差异表达基因进行KEGG通路分析，统计每个通路中包含的差异表达基因的个数，可找出显著富集的通路。3。2结果分析3。2。1RNA质量评估结果提取小豆JN6和CWA093两份材料的腹缝线和背缝线总RNA，通过NanoDrop8000微量分光光度计进行纯度检测，用Agilent2100Bioanalyzer，AgilentRNA6000NanoKit进行浓度和完整性检测，每个样品RNA浓度和总量均达到测序要求，OD260280在1。82。2之间，RNA分子完整数在7。08。1之间，如表31所示。可用于后续建库和测序。样品名称浓度（ngμl）体积（μl）总量（μg）OD260280RINCWA093F1101343。41。87。8CWA093F21124551。88CWA093F3694431。87。8CWA093B1142304。32。17。7CWA093B2166396。51。98。1CWA093B3124445。51。97JN6F1202325。82。17。7JN6F2205306。22。17。6JN6F3111475。21。87。7JN6B1271328。72。27。9JN6B21223341。87JN6B370523。61。97。73。2。2RNASeq测序结果及分析通过MGIT7平台一共测了12个样本，每个样品平均产出6。89Gb数据。平均有93。36%reads比对到参考基因组上。将测序reads比对到参考基因组并重构转录本之后，最终一共检测出22966个新转录本其中20817个属于已知蛋白编码基因的新的可变剪接亚型，673个属于新的蛋白编码基因的转录本，剩下的1476个属于长链非编码RNA。RNASeq测序的每个cDNA文库去除接头序列及低质量序列后，获得的Cleanreads均在44。0240M以上，每个文库cleanreads的Q20百分比在97。07%以上，Q30百分比在91。13以上，GC含量在44。05%46。72%之间。结合以上数据可以说明转录组测序质量较高，符合进一步的生物信息学分析要求，如表32。表32过滤后的reads数据量及质量统计表Table32StatisticsofthevolumeandqualityofreadsdataafterfilteringSampleCleanReads(M)CleanBases(G)Q20(%)Q30(%)GC(%)ReadLength(bp)CWA093B147。8901M7。1835G97。3592。4444。79150CWA093B246。1800M6。9270G97。6793。3346。72150CWA093B346。5180M6。9777G97。2892。2845。02150CWA093F145。9711M6。8957G97。4092。6945。60150CWA093F247。1443M7。0716G97。4892。8345。35150CWA093F344。0240M6。6036G97。3392。4245。55150JN6B146。1101M6。9165G97。5392。9244。62150JN6B246。2659M6。9399G97。2692。1645。09150JN6B345。8112M6。8717G97。8293。7845。09150JN6F143。9848M6。5977G98。6395。2645。05150JN6F246。9749M7。0462G97。4492。6844。78150JN6F345。9913M6。8987G97。4992。8044。421503。2。3PCA主成分分析主成分分析（principalcomponentsanalysis，PCA）是一种分析、简化数据集的技术。通过PCA分析发现小豆不裂荚材料JN6的腹缝线和背缝线聚类在一起；裂荚材料CWA093的腹缝线和背缝线均聚类在一起。表明裂荚与不裂荚材料间受不同的表达模式影响。注：X轴代表第一主成份的贡献率，Y轴代表第二主成份的贡献率。点代表每个样品，同一个颜色代表同一个样品组。3。2。4差异表达基因分析对裂荚材料CWA093与不裂荚材料JN6的背缝线和腹缝线分别进行差异表达基因进行分析，结果显示在背缝线中存在3150个差异表达基因，1642个基因显著上调，1508个基因显著下调。在腹缝线中1523个差异表达基因，783个基因显著上调，740个基因显著下调。通过韦恩图发现，2071个基因只在背缝线中存在差异表达，444个基因只在腹缝线中存在差异表达，1079个基因均在差异表达。背缝线中差异表达基因数量是腹缝线的两倍，韦恩图也表明在背缝线中差异表达基因存在较大差异，这与表型观察中小豆裂荚过程从背缝线开始这一结果一致，说明在裂荚过程中，背缝线具有主要作用，是我们的主要研究对象。3。2。5腹缝线中差异表达基因分析为了探究小豆裂荚调控机制，对裂荚材料CWA093与不裂荚材料JN6的腹缝线的差异表达基因进行了GO和KEGG功能富集分析。结果显示有684个差异表达基因注释到生物学过程（biologicalprocessBP）中（图），其中富集最多的是代谢过程（metabolicprocess，37。6%），201个差异表达基因注释到细胞组分（cellularcomponentCC），富集最多的是细胞解刨实体（cellularanatomicalentity，57。7%），660个差异表达基因注释到分子功能（molecularfunctionMF），富集最多的是结合（binding，48。8%），其次是催化活性（catalyticactivity，40。2%）。以p＜0。05进行筛选差异表达基因的显著富集途径，结果显著富集在20个GO条目中，在分子功能中富集显著性前10的条目为氧化还原酶活性、催化活性、O甲基转移酶活性、葡萄糖基转移酶活性、吡咯结合、红素结合、转移酶活性，转移己糖基团、ADP结合、铁离子结合、UDP葡萄糖基转移酶活性。生物学过程中，氧化还原过程、防御反应、对生物刺激的反应、细胞碳水化合物代谢过程、细胞呼吸、压力反应条目显著富集。图腹缝线差异表达基因GO功能注释腹缝线差异表达基因GO注释基因本体分类基因本体编号基因本体所属术语PvalueBPGO:0055114oxidationreductionprocess2。23E05BPGO:0006952defeerespoe6。02E05BPGO:0009607respoetobioticstimulus0。0007BPGO:0044262cellularcarbohydratemetabolicprocess0。00102BPGO:0045333cellularrespiration0。0329BPGO:0006950respoetostress0。04151CCGO:0005576extracellularregion0。00543CCGO:0048046apoplast0。01791CCGO:0016020membrane0。0234MFGO:0016491oxidoreductaseactivity3。19E08MFGO:0003824catalyticactivity7。82E08MFGO:0008171Omethyltraferaseactivity0。00024MFGO:0046527glucosyltraferaseactivity0。00082MFGO:0046906tetrapyrrolebinding0。00102MFGO:0020037hemebinding0。0019MFGO:0016758traferaseactivitytraferringhexosylgroups0。00436MFGO:0043531ADPbinding0。01003MFGO:0005506ironionbinding0。01161MFGO:0035251UDPglucosyltraferaseactivity0。04713在腹缝线中1523个差异表达基因被富集到122条通路中，其中显著富集的通路有13条（Pvalue0。05），主要包括次级代谢物的生物合成、代谢途径、苯丙氨酸生物合成、光合作用、类黄酮生物合成、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、半胱氨酸和蛋氨酸代谢等。腹缝线差异表达基因Kegg富集编号ID注释DescriptionP值Pvalueko01110Biosynthesisofsecondarymetabolites1。43E07ko01100Metabolicpathways2。07E06ko00940Phenylpropanoidbiosynthesis2。78E05ko00195Photosynthesis3。72E05ko00941Flavonoidbiosynthesis0。000479637ko00280Valineleucineandisoleucinedegradation0。003344125ko00270Cysteineandmethioninemetabolism0。005101411ko00945Stilbenoiddiarylheptanoidandgingerolbiosynthesis0。01085581ko00904Diterpenoidbiosynthesis0。01445445ko00908Zeatinbiosynthesis0。01450392ko00071Fattyaciddegradation0。02412561ko02010ABCtraporte0。02967792ko00603Glycosphingolipidbiosynthesisgloboandisogloboseries0。047096963。2。6背缝线中差异表达基因分析对裂荚材料CWA093与不裂荚材料JN6的背缝线的差异表达基因进行了GO和KEGG功能富集分析。结果显示有2483个差异表达基因注释到生物学过程（biologicalprocessBP）中（图），其中富集最多的是代谢过程（metabolicprocess，39。1%），608个差异表达基因注释到细胞组分（cellularcomponentCC），富集最多的是细胞解刨实体（cellularanatomicalentity，67。9%），2423个差异表达基因注释到分子功能（molecularfunctionMF），富集最多的是结合（binding，46。5%），其次是催化活性（catalyticactivity，42。8%）。以p＜0。05进行筛选差异表达基因的显著富集途径，结果显著富集在31个GO条目中，细胞组分中。。。
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